Phân loại nấm bằng hình thái
- Nấm đƣợc cấy trên môi trƣờng LCA trên đĩa Peptri, trong tủ 250C từ 1-2 tuần. Quan sát trực tiếp khuẩn lạc dƣới kính quang học với độ phóng đại 200 lần.
- Nhỏ một giọt xanh cotton blue 0.1% (hoặc nƣớc vô trùng) lên lam kính có chứa khuẩn lạc nấm. Đặt lamen lên, quan sát dƣới kính hiển vi quang học với các vật kính có độ phóng đại 400 lần và 1000 lần. Đo kích thƣớc, và chụp ảnh hình thái cấu trúc các cơ quan sinh sản của nấm. Sau đó so sánh với khóa phân loại của các tác giả uy tín trên thế giới nhƣ Klich, Keith, Domsch, Seifert tìm ra sự tƣơng đồng giữa hình ảnh của chủng nấm cần phân loại và hình ảnh trong sách, từ đó đƣa ra kết luận. Phân loại nấm bằng sinh học phân tử
Tách ADN cho phản ứng PCR John Pitkin
Phản ứng PCR Hỗn hợp phản ứng: 10X Buffer 10µl dNTP mixture 16µl Mồi xuôi 2µl Mồi ngƣợc 2µl TaqTm 1.2 µl Mẫu ADN (50 ng) 1 µl Nƣớc cất đến 100µl
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Mồi ngƣợc ITS4: 5' - TCCTCCGCTTATTGATATGC - 3' Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR
Kiểm tra các sản phẩm PCR trên gen agarose
Tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit của QIAgen (Invitrogen, Đức). Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu.
Phản ứng khuếch đại ADN cho sequencing.
Các sản phẩm PCR tinh sạch đƣợc khuếch đại với bộ kít ABI PRISM Cycle sequencing và đệm 5X sequence (Perkin-Elmer Applied Biosystem)
Chu trình nhiệt khuếch đại ADN cho sequencing: Sản phẩm lúc này là các đoạn ADN đơn đƣợc duỗi ra.
Tinh sạch sản phẩm cho sequencing.
Đọc trình tự ADN. Trình tự của đoạn D1/D2 rADN 28S của chủng nấm đƣợc đọc trực tiếp trên máy đọc trình tự tự động 3100 Avant. Sau đó kết quả trình tự đƣợc so sánh với các trật tự của các loài đã đƣợc xác định trong ngân hàng gen.
Xây dựng cây phân loại sử dụng phần mềm Cluxstal phiên bản 1.83 và NJ tree.