dõi
Kết luận: 08 chủng nấm lựa chọn hoàn toàn là an toàn với động vận thử nghiệm là các chủng NR1, NR4, NR5, NR7, NR8, NR11, NR12, NR13, có thể làm chế phẩm thử nghiệm trên đối tƣợng cây trồng.
3.4.6. Định tên phân loại một số chủng nấm vùng rễ và lựa chọn tạo chế phẩm thử nghiệm. thử nghiệm.
Các chủng nấm vùng rễ trên đƣợc định tên bằng sinh học phân tử hoặc hình thái học.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Đặc điểm quan sát hình dạng khuẩn lạc trên thạch đĩa:
Khuẩn lạc lúc non có màu sữa trắng, sau ngả dần sang màu hoa cau, khi già có màu phấn hồng. Sợi nấm màu trắng. Mặt trái khuẩn lạc có màu nâu, có hiện tƣợng tiết sắc tố ra thạch khi già.
Các đặc điểm quan sát hình thái dưới kính hiển vi quang học:
Cuống sinh bào tử hình thành từ sợi khí sinh hoặc hình thành từ đám đĩa sợi. Dạng điển hình, phân nhánh đơn giản (2-3 nhánh), kích thƣớc cuống 10-30 µm. Thể bình hình chai, thƣờng 2-4 thể bình/ cuống, kích thƣớc thể bình 10-17 x 1-2 µm. Bào tử hình elip hoặc hình cầu nhẵn, không có gai, kích thƣớc 2,7 x 3,5 µm. Có sự xuất hiện thể quả trên khuẩn lạc, màu hồng phấn, kích thƣớc đạt 100-300 µm.
Đây là hình thái của chi Talaromyces (thuộc chi Penicillium có xuất hiện giai đoạn hữu tính).
Xác định trình tự đoạn ITS của rDNA
Trình tự rDNA đoạn ITS của chủng NR1 có độ tƣơng đồng 100% (510/510) so với loài Talaromyces flavus, cây phát sinh chủng loại của NR1 dựa vào trình tự rADN vùng ITS cho thấy NR1 nằm trên cùng 1 nhánh nhỏ với Talaromyces flavus.
Kết luận: chủng NR1 thuộc về loài Talaromyces flavus
Hình 3.5. Hình ảnh khuẩn lạc và bào tử của chủng NR1
Chủng NR4
Khuẩn lạc:màu vàng đến vàng chanh, mặt trái có màu vàng đến đỏ nhạt.
Chổi: thƣờng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
T : 7,0 - 8,0 m x 2,0- 2,5 m.
B : 2,5 - 3,0 m x 2,0- 2,5 m.
T : 500 m, asci 8,0- 10 .
B : 4,0 - 5,0 m x 3,0- 3,5 m.
Đây là hình thái của Penicillium vermiculatum Dangeard. Chủng nấm thuộc chi
Penicillium đƣợc ký hiệu là Penicilliumvermiculatum NR4
Hình 3.6. Ảnh hiển vi của Penicilliumvermiculatum NR4
Chủng NR5.
Khuẩn lạc: lúc đầu màu trắng, sau trở thành màu vàng nâu ở vùng mép, vài vùng bên trong mép có màu tím hồng nhạt, mặt dạng nhung hoặc hơi xốp bông, các rãnh xuyên tâm rõ rệt ở vùng giữa. Mặt trái khuẩn lạc màu vàng, vàng nâu.
Giá bào tử trần: nhẵn, phát triển từ các sợi nấm khí sinh, hầu hết có kích thƣớc 20-40 x 2-3 m. Giá mang ở ngọn một vòng 3-4 thể bình hoặc 1-2 thể bình.
Thể bình: khi thành vòng 8-12 x 2-3 m, khi đơn độc có thể dài tới 20 m.
Bào tử trần: hình thành chuỗi ngắn, phân ly, nhẵn, hình gần cầu hoặc trứng, 4- 7 m x3,5-5,0 m, có nhiều kích thƣớc khác nhau trên cùng 1 chổi.
Thể quả: màu nâu, hình cầu, gần cầu, 50-100 m đƣờng kính. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Túi bào tử: hình thành sau 5-10 ngày nuôi cấy, đơn độc, hình cầu hoặc trứng, 8- 10 m, chứa 8 bào tử túi.
Bào tử túi: hình trứng hoặc elíp, thành dày, nhẵn, không có rãnh quỹ đạo rõ rệt, 3,5-4,5 m x 3-4 m.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Đây là hình thái của Penicillium levitum Raper and Fennell. Chủng nấm thuộc chi
Penicillium đƣợc ký hiệu là Penicilliumlevitum NR5
Hình 3.7. Ảnh hiển vi của Penicilliumlevitum NR5
Chủng NR7
Đặc điểm quan sát hình dạng khuẩn lạc trên thạch đĩa:
Khuẩn lạc trên môi trƣờng MEA phát triển tƣơng đối nhanh, kích thƣớc khuẩn lạc 4-5cm sau 7 ngày nuôi cấy. Lúc còn non có màu trắng, khi già xuất hiện thể quả (hiện tƣợng sợi bện chặt trên bề mặt khuẩn lạc tạo thành đĩa sợi dầy). Sợi nấm màu trắng. Mặt trái khuẩn lạc không màu, không có hiện tƣợng tiết sắc tố ra ngoài môi trƣờng.
Các đặc điểm quan sát hình thái dưới kính hiển vi quang học:
Hình thành cả giai đoạn vô tính và hữu tính trên môi trƣờng nuôi cấy.
Giai đoạn vô tính: Cuống sinh bào tử mọc từ sợi khí sinh, đơn giản, phân nhánh đơn giản (2-3 nhánh), kích thƣớc cuống 9-14 µm. Thể bình hình chai, thót nhọn phía trên, thƣờng 2-4 thể bình/ cuống, kích thƣớc thể bình 9-12 x 1-2 µm. Bào tử hình elip hoặc hình cầu nhẵn, không có gai, kích thƣớc 3,5-5 µm (gần cầu); 3-4 x 2,5-3 µm (elip).
Giai đoạn hữu tính: Thể quả rất nhiều đƣợc bao quanh bởi hệ sợi chằng chịt, tạo thành đĩa thể quả, hình cầu, gần cầu, màu vàng nhạt, kích thƣớc 100-300 µm.
Đây là hình thái của chi Talaromyces hoặc Eupenicillium (là chi Penicillium có xuất hiện giai đoạn hữu tính).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Xác định trình tự đoạn ITS của rDNA
Trình tự rDNA đoạn ITS của chủng NR7 có độ tƣơng đồng 99,8 % (510/510) so với Talaromyces gossypii JN899334, cây phát sinh chủng loại của NR7 dựa vào trình tự rADN vùng ITS cho thấy NR7 nằm trên cùng 1 nhánh nhỏ với Talaromyces gossypii
Kết luận: Chủng NR07 là loài gần gũi với Talaromyces gossypii
Hình 3.8. Ảnh cuống sinh bào tử, bào tử (trái) và thể quả (ảnh phải) của chủng NR7
Chủng NR8
Đặc điểm quan sát hình dạng khuẩn lạc trên thạch đĩa:
Khuẩn lạc trên môi trƣờng MEA phát triển tƣơng đối nhanh, kích thƣớc khuẩn lạc 4-5cm sau 7 ngày nuôi cấy. Khuẩn lạc lúc đầu có màu trắng, sau chuyển sang màu vàng xuộm, bào tử màu xanh xám. Mặt trái khuẩn lạc có màu vàng, không có hiện tƣợng tiết sắc tố ra thạch khi già.
Các đặc điểm quan sát hình thái dưới kính hiển vi quang học:
Hình thành cả giai đoạn vô tính và hữu tính trên môi trƣờng nuôi cấy. Giai đoạn hữu tính xuất hiện muộn (sau 4 tuần nuôi cấy).
Giai đoạn vô tính: Cuống sinh bào tử mọc từ sợi khí sinh, đơn giản, phân nhánh, các nhánh không thƣờng xuyên tỏe đều, kích thƣớc cuống 9-34 µm. Thể bình hình chai, thót nhọn phía trên, thƣờng 2-4 thể bình/ cuống, kích thƣớc thể bình 9-12 x 1- 2 µm. Bào tử hình elip hoặc hình cầu nhẵn, không có gai, kích thƣớc 3,5-5 µm (gần cầu); 3-4 x 2,5-3 µm (elip).
Giai đoạn hữu tính: Thể quả rất nhiều đƣợc bao quanh bởi hệ sợi chằng chịt, tạo thành đĩa thể quả, hình cầu, gần cầu, màu vàng nhạt, kích thƣớc 100-300 µm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Đây là hình thái của chi Eupenicillium (là chi Penicillium có xuất hiện giai đoạn hữu tính).
Xác định trình tự đoạn ITS của rDNA
Trình tự rADN đoạn ITS của chủng NR8 có độ tƣơng 100% so với loài (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Eupenicillium ochrosalmoneum, cây phát sinh chủng loại của NR5 dựa vào trình tự rADN vùng ITS cho thấy NR5 nằm trên cùng 1 nhánh nhỏ với Eupenicillium ochrosalmoneum.
Kết luận: Chủng NR8 là loài Eupenicillium ochrosalmoneum
Hình 3.9. Khuẩn lạc và cơ quan sinh sản của chủng NR8
Chủng NR11
Đặc điểm quan sát hình dạng khuẩn lạc trên thạch đĩa:
Khuẩn lạc phát triển nhanh trên môi trƣờng, đạt kích thƣớc 5-6cm sau 10 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 250C (môi trƣờng PDA), khuẩn lạc lúc đầu màu kem sau chuyển sang màu nâu nhạt. Mặt trái nâu, tiết ra môi trƣờng nâu nhạt.
Các đặc điểm quan sát hình thái dưới kính hiển vi quang học:
Cuống sinh bào tử màu nâu nhẹ, kích thƣớc đạt từ 4-5 µm, phần cuối cùng của cuống sinh bào tử phình to, tạo thành bọng hình cầu, gần cầu kích thƣớc (48)65- 90 (100)- 200 µm.
Thể bình chủ yếu là 2 tầng, kích thƣớc thể bình sơ cấp 2-5 x3-7 µm, thể bình thứ cấp kích thƣớc 1.5-2 x 3-10 µm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bào tử tƣơng đối nhẵn, hình cầu, gần cầu kích thƣớc đạt 3-6 µm. Xuất hiện cả bào tử dạng aleuro spore.
Đây là hình dạng điển hình của Aspergillus terreus (Marren Klick 2004).
Xác định trình tự đoạn ITS của rDNA
Trình tự rADN đoạn ITS của chủng NR11 có độ 100% (600/600) so với loài
Aspergillus terreus và Aspergillus carneus, cây phát sinh chủng loại của NR8 dựa vào trình tự rADN vùng ITS cho thấy NR8 nằm trên cùng 1 nhánh nhỏ với
Aspergillus terreus
Kết luận: Chủng NR11 là loài Aspergillus terreus.
Hình 3.10. Khuẩn lạc và cơ quan sinh sản của chủng NR11
Chủng NR12
Đặc điểm quan sát hình dạng khuẩn lạc trên thạch đĩa:
Khuẩn lạc: phát triển nhanh 5-6mm sau 10 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 250C (môi trƣờng PDA), sợi nấm màu trắng, bào tử trên bề mặt khuẩn lạc tạo thành đám dày đặc, màu xanh rêu. Mặt trái màu kem nhạt.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Cuống sinh bào tử không màu , nhẵn, kích thƣớc đạt từ 3-5 µm, phần cuối cùng của cuống sinh bào tử phình to, tạo thành bọng hình cầu, gần cầu kích thƣớc 25-50 µm.
Thể bình 1 tầng, bao phủ 1/3 diện tích bề mặt bọng. Kích thƣớc 2-4x1,5-2µm.
Bào tử hình cầu, kích thƣớc đạt 4-6 µm.
Đây là hình dạng điển hình của loài Aspergillus fumigatus [Raper & Fennell, 1965].
Xác định trình tự đoạn ITS của rDNA
Trình tự rADN đoạn ITS của chủng NR12 có độ 100% (600/600) so với loài
Aspergillus fumigatus cây phát sinh chủng loại của NR12 dựa vào trình tự rADN vùng ITS cho thấy NR9 nằm trên cùng 1 nhánh nhỏ với Aspergillus fumigatus
Kết luận: Chủng NR12 là loài Aspergillus fumigates. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.11. Khuẩn lạc và cơ quan sinh bào tử của chủng NR12
Chủng NR13
Khuẩn lạc: màu lục nhạt. Mặt trái và môi trƣờng xung quanh màu vàng lục.
Thể bình: không thành cụm, không mập, hơi thót đáy.
Bào tử trần: hầu hết hình elíp, 3-7,5 x 3-3,5µm.
Giá bào tử trần: cuống sinh bào tử trần và các nhánh dài, không dày
Trình tự rADN đoạn D1D2 của chủng NR13 cho thấy chủng nấm thuộc chi
Trichoderma, và đƣợc kí hiệu Trichoderma sp NR13. Trình tự rADN đoạn D1D2 của chủng NR13 giống 100% so với trình tự này của loài Trichoderma konilangbra
AF399238.1 công bố trong GenBank. Trình tự gen rADN đoạn D1D2 của NR13. Đây là hình thái của chi Trichodermakonilangbra sp.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.12. Ảnh hiển vi của Trichodermakonilangbra NR13
Đã lựa chọn đƣợc 6 chủng tạo chế phẩm thử nghiệm đó là các chủng Talaromyces flavus NR1, Penicillium vermiculatum NR4, Penicillium levitum NR5,
Talaromyces gossypii NR7, Eupenicillium ochrosalmoneum NR8, Trichoderma
konilangbra NR13.