43 Hình 2. 5. Vị trí lấy mẫu nước và trầm tích sơng Cầu tại TP. Thái Nguyên
2.2.2.2. Phân tích thành phần lý hóa của mẫu nước và trầm tích
a. Mẫu nước:
- Nhiệt độ, pH, độ dẫn điện, tổng chất rắn hòa tan (TDS), oxy hòa tan (DO), thế oxy hóa được đo tại hiện trường bằng thiết bị cầm tay đo đa chỉ tiêu 650 MDS (YSI - Mỹ);
- Hàm lượng TSS được xác định tại phịng thí nghiệm bằng phương pháp khối lượng theo TCVN 6625:2000/ ISO 11923:1997;
44 - Các ion hòa tan trong nước (NH4+; Na+; K+; Mg2+; Ca2+) được phân tích tại phịng thí nghiệm theo TCVN 6660:2000 (ISO 14911:1988) bằng máy sắc ký ion IC CBM- 20A DGU-20.
- Chỉ tiêu E.coli được phân tích theo TCVN 6187-1:2009 (ISO 9308-1:2000); b. Mẫu trầm tích
- Độ ẩm: được thực hiện theo tiêu chuẩn TCVN 4048:2011 bằng phương pháp sấy khô ở nhiệt độ 105oC;
- pH: được xác định bằng tiêu chuẩn TCVN 6492:2011 (ISO 10523:2008); - Phân bố kích thước hạt và thành phần sét được xác định dựa trên TCVN 6862:2001 (ISO 11277:1998);
- Thành phần carbon hữu cơ (TOC) được xác định dựa trên phương pháp đốt khô (TCVN 6642:2000/ ISO 10694:1995) bằng máy phân tích carbon TOC-Vcph (Shimadzu, Nhật Bản);
2.2.2.3. Xử lý mẫu phân tích PPCPs
Trong q trình phân tích các hợp chất hữu cơ, một trong những yếu tố quyết định sự thành cơng trong việc định tính và định lượng tốt các hợp chất PPCPs là quy trình xử lý mẫu sơ bộ trước khi phân tích. Q trình xử lý mẫu được tham khảo từ quy trình nội bộ phân tích PPCPs của Trung tâm Quản lý Chất lượng Mơi trường – Đại học Kyoto. Phương pháp này được phát triển từ hướng dẫn trong tiêu chuẩn EPA 1694 (Cơ quan bảo vệ Mơi trường – Mỹ) và phương pháp phân tích PPCPs của Phịng nghiên cứu kỹ thuật môi trường, Trường Đại học Massachusetts – Mỹ [81].
a. Xử lý mẫu nước
Xử lý mẫu sơ bộ bao gồm các quá trình lọc mẫu và chiết tách mẫu. Quá trình chiết nhằm (1) tách các chất cần phân tích ra khỏi những hợp chất không mong muốn, (2) làm giàu các chất cần phân tích, và (3) làm sạch mẫu trước khi tiến hành phân tích bằng các kỹ thuật lựa chọn.
Q trình xử lý mẫu nước có thể được chia làm bốn bước bao gồm: (1) lọc để loại bỏ chất rắn, (2) loại bỏ các yếu tố ảnh hưởng; (3) hấp thụ các chất cần phân tích lên pha rắn; (4) tách các chất cần phân tích ra pha lỏng (Hình 2.6).
45 Tại phịng thí nghiệm, mẫu nước được lọc qua giấy lọc sợi thủy tinh GF/B với kích thước lỗ 0,45m để tách chất rắn lơ lửng. Sau đó Ascorbic acid và EDTA được thêm vào mẫu ở nồng độ 1 g/L để duy trì pH tối ưu cho q trình chiết. Ngồi ra, các chất đồng hành được thêm vào với lượng 50 μg.
Hình 2. 6. Quy trình xử lý mẫu nước
Quá trình chiết pha rắn (SPE) bằng catridge Oasis HLB (500 mg in 6 cc, Waters, Japan). Trước khi xử lý mẫu, các cột chiết pha rắn được được hoạt hoá bằng 20 mL
20 mL MeOH 6 mL Water 6 mL 10 mMol HCl 12 mL MeOH 6 mL MeOH/Acetone Hỗn hợp chất đồng hành (Surrogate standards) Lọc mẫu
(0,45m glass fiber filter)
Mẫu nước (500 mL) Dịch lọc Ascorbic acid (0,5g) & EDTA (0,5g) Làm khô bằng khơng khí (60 min) Rửa giải 6 mL Methanol Sấy khơ Khí N2
1 mL 0,1% formic acid & methanol (85:15, v/v) 1 mL mẫu sau xử lý
Chiết pha rắn Oasis HLB 6cc
46 Methanol (loại dùng cho LC/MS) sau đó là 6 mL nước deion (Milli-Q) với tốc độ là 5mL/phút. Sau đó mẫu được hút chảy qua cột chiết pha rắn với tốc độ dòng chảy là 10 mL/phút được duy trì trong tồn bộ quá trình chiết mẫu. Tiếp theo, các cột chiết pha rắn được làm khô bằng khơng khí trong vịng hai (02) giờ trước khi tiến hành rửa giải. Hợp chất PPCPs được rửa giải ra khỏi cột chiết pha rắn bằng 6 mL Methanol LC/MS. Dung dịch rửa giải thu được được chuyển vào ống nhựa trơ dung tích 20 mL, được làm khơ bằng dịng khí nitơ sau đó được hịa tan bằng 1 mL dung dịch 0,1% formic acid và MeOH (85:15, v/v). Như vậy qua quá trình xử lý mẫu các hợp chất cần phân tích trong mẫu đã được làm giàu lên đến 500 lần.
(a) Bộ chiết pha rắn SPE (b) Bộ chiết dung môi nhanh ASE Hình 2. 7. Các thiết bị hỗ trợ tách và làm giàu chất phân tích
b. Xử lý mẫu trầm tích
Mẫu trầm tích được chiết bằng kỹ thuật chiết gia tốc dung mơi ASE. Mẫu trầm
tích được để khơ tự nhiên ở nhiệt độ phịng trong 24 giờ. Sau đó, mẫu được cân với khối lượng xác định (0,2 ÷ 0,3) g đưa vào cell chiết của hệ ASE (Hình 2.7(b)). Dung dịch chuẩn chứa hỗn hợp các chất đồng hành được thêm vào mẫu. Điều kiện chiết như sau: nhiệt độ chiết 100 oC, áp suất 2000 psi, thời gian ngâm chiết 10 phút, quá trình chiết lặp lại 3 lần. Dung môi chiết là hỗn hợp methanol/nước (1:1, v/v) với 0,5% (v/v) dung dịch đệm amonia (pH = 11). Dịch chiết thu được có thể tích ~60 mL, được pha lỗng bằng nước tinh khiết MiliQ sao cho nồng độ methanol trong dịch chiết < 5 % (v/v) và được tiếp tục thực hiện quá trình chiết pha rắn giống như mẫu nước.
47 Các thiết bị được sử dụng trong quá trình xử lý mẫu bao gồm:
(1) Bộ chiết pha rắn SPE 12 cổng Visiprep™ (SPE Vacuum Manifold DL, 12- port model), hãng sản xuất: Supelco, Mỹ. Cột chiết pha rắn được sử dụng cho quá trình chiết Oasis HLB (Water- Mỹ).
(2) Bộ chiết gia tốc dung môi ASE 350 của hãng Thermo Scientific Dionex (Mỹ). Đây là thiết bị tự động chiết, lọc và làm sạch các hợp chất từ các mẫu rắn và bán rắn trong bằng cách sử dụng nhiệt độ và áp suất cao, thay thế phương pháp chiết cũ với thiết bị chiết Soxhlet, bể siêu âm, máy khuấy.
Hình 2. 8. Quy trình xử lý mẫu trầm tích Hỗn hợp chất Hỗn hợp chất
đồng hành
Mẫu trầm tích (0,2 g)
Chiết nhanh với dung môi (ASE)
(Accelerated Solvent Extraction)
ASE extracts
+ 90 mL milli-Q water + 0,1 g ascorbic acid + 0,1 g EDTA Chuyển mẫu sang chiết pha rắn
SPE cartridge
(preconditioned SPE cartridge) (*)
Sấy (air drying)
Pha loãng
Methanol
Làm khô
Nitrogen
1 mL 0,1% formic acid & methanol (85:15, v/v)
1 mL mẫu đã xử lý để phân tích trên LC/MS/MS Methanol 10 mL
Điều kiện chiết ASE:
Nhiệt độ: 100 oC
Dung mơi chiết: MeOH
Thể tích dung mơi chiết: 20x3 (mL) Khối lượng mẫu: (0,2 ÷ 0,3)g Áp suất: 2000 psi
48
c. Các hóa chất được sử dụng trong q trình phân tích:
Trong 56 chất chuẩn (cùng chất đồng hành tương ứng (Bảng PL10)) bao gồm 30 chất thuộc nhóm thuốc kháng sinh, 12 chất thuộc nhóm thuốc giảm đau, 4 chất thuộc nhóm thuốc chống động kinh, 4 chất thuộc nhóm giãn mạch máu và 6 chất thuộc nhóm các PPCPs khác. Các chất này hầu hết được cung cấp bởi Wako Chemical (Nhật Bản), chỉ riêng Azithromycin/Levofloxacin và chất đồng hành của chúng được mua từ Cơng ty hóa chất Fluka (Nhật Bản). Ascobic acid và EDTA mua từ Cơng ty hóa chất Kanto (Nhật Bản); Formic acid và MeOH mua từ Cơng ty hóa chất Baker (Mỹ). Các chất đồng hành đóng vai trị loại bỏ các yếu tố ành hưởng đến độ thu hồi trong quá trình tách chiết, làm giàu và sai số khi phân tích mẫu. Tồn bộ các hóa chất được sử dụng có độ tinh khiết cao (>98%) (HPLC-grade level) như quy định trong tiêu chuẩn EPA 1694 (2007).
2.2.2.4. Định lượng PPCPs trong các dịch chiết
Các PPCPs trong các dịch chiết từ các mẫu nước và trầm tích được định lượng bằng phương pháp LC/MS/MS.
Đối với các mẫu thuộc giai đoạn khảo sát, sàng lọc, PPCPs trong các dịch chiết được định lượng tại phịng thí nghiệm thuộc Trung tâm quản lý chất lượng môi trường – Đại học Kyoto sử dụng hệ UPLC (ACQUITY UPLC, Waters, USA) kết nối với detector MS/MS (Quattro micro API, Waters, USA). Các điều kiện phân tích bao gồm khối phổ, pha tĩnh và pha động được thiết lập như sau
Khối phổ: Các điều kiện cài đặt cho khối phổ (MS) ba tứ cực Agilent 6420 với
điều kiện:
+ Chế độ ion hoá điện tử dương (ESI+) sử + Cell Accelerator Voltage: 7 V. + Nebulizer: 35 psig. + Polarity: Positive.
+ Gas flow: 11 L/phút. + Scan Type: MRM.
+ Capillary: 4000 V. + Dwell time: 200 msec. + Gas Temp: 350 oC. + Delta EMV(+): 100.
+ Delta EMV(-): 20
Các thông số về ion mẹ, mảnh phổ, năng lượng phân mảnh F và năng lượng va chạm CE được liệt kê trong Bảng PL10.
49
Pha tĩnh: Theo bản chất của các chất cần phân tích, các chất PPCPs trong nghiên
cứu này là các chất phân cực nên cột tách cần sử dụng là cột tách pha đảo (RP). Cột BEH C18 (2,1 mm x 100 mm x 1,7μm - octadecylsilica-based) hãng Waters – Mỹ được sử dụng trong nghiên cứu này.
Pha động: kênh A nước cất chứa 0,1% HCOOH và kênh B MeOH, tốc độ dòng:
0.35 mL/phút.
Bảng 2. 2. Chương trình chạy pha động
Thời gian (phút) Kênh A (%) Kênh B (%) 0 90 10 7.0 90 10 7.1 80 20 8.0 80 20 13.0 50 50 16.0 50 50 16.1 40 60 20.0 30 70 21.0 5 95 23.0 5 95 23.1 90 10 26.0 90 10
Đối với nghiên cứu đánh giá chi tiết phân bố 04 PPCPs điển hình trong nước và trầm tích sơng Cầu đoạn chảy qua Thái Nguyên được định lượng bằng LC/MS/MS theo quy trình phân tích được nghiên cứu thiết lập tại phịng thí nghiệm của Viện Đo lường Việt Nam.
2.2.3. Xác định các chất điển hình
Mức độ điển hình của các PPCPs được xác định dựa trên các yếu tố gồm nồng độ, tần suất và khả năng gây ảnh hưởng độc hại, thông qua chỉ số ảnh hưởng InI (Influence Index). Nó là tổng hợp ảnh hưởng cả trong mơi trường nước và trầm tích, được tính theo cơng thức sau:
𝐼𝑛𝐼 = [𝑃𝑛× 𝐶𝑛 ∑ 𝐶𝑛 + 𝑃𝑡𝑡× 𝐶𝑡𝑡 ∑ 𝐶𝑡𝑡 ] × 1 𝑃𝑁𝐸𝐶𝑛 (2.6)
50
Trong đó:
+ Pn, Ptt : Tần suất phát hiện trong mẫu nước/trầm tích;
+ Cn, Ctt: nồng độ chất phân tích trong nước (ng/L)/trầm tích (µg/kg); + PNECn: ngưỡng khơng nguy hại trong nước;
+ ∑ 𝐶𝑛, ∑ 𝐶𝑡𝑡: Tổng nồng độ PPCPs trong nước/ trầm tích.
2.2.4. Phương trình cân bằng vật chất
Phương trình cân bằng vật chất dùng để tính lưu lượng dịng nhánh đổ vào sơng Cầu dựa trên sự biến đổi nồng độ của thơng số mang tính chất vật lý như tổng chất rắn hịa tan (TDS, g/m3).
Với Q1 (m3/s) là dịng chính, Q2 (m3/s) là dòng nhánh đổ vào Q1. Với các đại lượng TDS dịng chính, dịng nhánh và sau hợp lưu được đo trực tiếp tại hiện trường, lưu lượng Q1 lấy từ trạm quan trắc, áp dụng cân bằng vật chất cho chất rắn hịa tan ta có:
𝑄1× 𝑇𝐷𝑆1+ 𝑄2× 𝑇𝐷𝑆2 = (𝑄1+ 𝑄2) × 𝑇𝐷𝑆3 (2.7) Từ đó có thể tính được lưu lượng dịng nhánh Q2
𝑄2 =𝑄1× (𝑇𝐷𝑆3 − 𝑇𝐷𝑆1)
𝑇𝐷𝑆2 − 𝑇𝐷𝑆3 (2.8)
2.2.5. Đánh giá mức độ ảnh hưởng của PPCPs đến các sinh vật thủy sinh
Mức độ ảnh hưởng của PPCPs trong nước và trầm tích sơng Cầu đến các sinh vật thủy sinh được đánh giá sơ bộ thông qua cách tiếp cận đánh giá rủi ro môi trường đa cấp (The multiple-level ecological risk assessment - MLERA) được thực hiện theo hướng dẫn kỹ thuật đánh giá rủi ro của NORMAN đối với các chất mới nổi [83] và nhiều những nghiên cứu khác [7, 18, 84]. Theo Hướng dẫn này, rủi ro môi trường sẽ quan tâm đến tác động tiềm tàng của các hợp chất riêng lẻ trong môi trường bằng
51 cách kiểm tra cả tác động của việc phơi nhiễm các hợp chất hóa học và ảnh hưởng của chúng đến cấu trúc và chức năng của hệ sinh thái. Tóm tắt ngắn gọn về phương pháp đánh giá được mô tả trong các phần sau.
2.2.5.1. Hệ số rủi ro (RQ- risk quotient) – đánh giá rủi ro ở mức độ sàng lọc
Rủi ro môi trường của hợp chất hóa học được tính tốn từ tỷ lệ PEC/PNEC (Predicted effect concentration – nồng độ dự báo ảnh hưởng/ Predicted no effect concentration – nồng độ dự báo khơng ảnh hưởng) có thể được biểu diễn thơng qua hệ số rủi ro (RQ). Mức độ phơi nhiễm được coi là tỷ lệ thuận với PEC và tỷ lệ nghịch với PNEC. Hệ số rủi ro RQ được xác định theo biểu thức:
𝑅𝑄 = 𝑃𝐸𝐶
𝑃𝑁𝐸𝐶 (2.9)
Nếu có sẵn các dữ liệu về nồng độ môi trường được đo đạc (MEC - Measured environmental concentration - Nồng độ chất ô nhiễm đo được), có thể sử dụng giá trị này để thay thế PEC, để tính tỷ lệ MEC/PNEC làm thước đo rủi ro RQ. Khi đó, rủi ro mơi trường của hợp chất hóa học có thể được phân loại thành các mức ý nghĩa theo RQ, được trình bày trong Bảng 2.2
Bảng 2. 3. Đánh giá rủi ro môi trường theo Hệ số rủi ro (RQ)
Mức rủi ro môi trường RQ
Không đáng kể < 0,1
Thấp (0,1 ÷ 1)
Trung bình (1 ÷ 10)
Cao > 10
2.2.5.2. Tần số vượt ngưỡng PNEC – Cách tiếp cận xác suất
Nồng độ hóa chất thấp hơn PNEC được coi là an toàn, trong khi nồng độ vượt quá PNEC có thể gây rủi ro cho các sinh vật dưới nước. Nồng độ đo được của các hóa chất mục tiêu tại các điểm lấy mẫu riêng lẻ được so sánh với các giá trị PNEC để xác định tần suất vượt quá PNEC. Các chất mục tiêu sau đó được đánh giá ưu tiên theo tỷ lệ nồng độ vượt quá PNEC [85].
𝐹 = 𝑛
52 Trong đó F là tần suất vượt ngưỡng PNEC, n là số vị trí có nồng độ trên PNEC và N là tổng số vị trí lấy mẫu của một hóa chất. Giá trị kết quả cho biết tỷ lệ các địa điểm mà các hành vi tiềm năng được mong đợi [86].
2.2.5.3. Chỉ số ưu tiên – Tối ưu hóa đánh giá rủi ro
Phương pháp tiếp cận RQ hiện tại dựa trên nồng độ trung bình trong nước có thể bị sai lệch bởi tần suất phát hiện. Do đó xu hướng là xem xét cả nồng độ và tần suất trong q trình sàng lọc hợp chất có nguy cơ gây rủi ro cao. Vì vậy, đánh giá rủi ro được tối ưu hóa được thực hiện theo một phương pháp luận được phát triển trong Mạng lưới NORMAN [7, 83]. Chỉ số ưu tiên (PI) được tính tốn như là kết quả của giá trị RQ nhân với tần suất vượt mức PNEC, để làm nổi bật các PPCPs tiêu điểm được quan tâm.
𝑃𝐼 = 𝑅𝑄 × 𝐹 (2.11)
Trong đó PI là chỉ số ưu tiên, RQ là hệ số rủi ro được tính tốn dựa trên nồng độ trung bình và PNEC, F là tần số của nồng độ vượt quá PNEC.
2.2.5.4.Tính tốn PNEC bằng cách sử dụng hệ số đánh giá
Nồng độ dự báo không ảnh hưởng (PNEC) là nồng độ của một chất trong bất kỳ thành phần môi trường nào mà các tác dụng phụ hầu như sẽ không xảy ra khi tiếp xúc lâu dài hoặc ngắn hạn. Giá trị PNEC thường được tính tốn bằng cách chia các chỉ số mơ tả liều lượng độc chất cho hệ số đánh giá (AFs).
Các chỉ số mô tả liều lượng được xác định trong các nghiên cứu độc tính về mối nguy hại của các hợp chất thường được sử dụng như LC50, LD50, NOAEL, NOAEC, NOEC, v.v. Trong đó, các giá trị được sử dụng thường xuyên nhất để tính tốn PNEC là tỷ lệ tử vong (LC50), tăng trưởng (ECx hoặc NOEC) và sinh sản (ECx hoặc NOEC).
LC50 / EC50: là nồng độ mà tại đó quan sát thấy 50% cá thể bị tử vong hoặcbị ức chế một chức năng. Kết quả này thường thu được từ các nghiên cứu độc chất sinh thái ngắn hạn.
NOEC (Nồng độ ảnh hưởng không quan sát được): là nồng độ cao nhất được thử nghiệm mà khơng thấy những ảnh hưởng khác biệt có ý nghĩa thống kê khi so sánh với nhóm đối chứng. Nó thường thu được từ các nghiên cứu độc chất sinh thái dài hạn.
53 ECx: Là nồng độ mà tại đó x% ảnh hưởng (50% đối với EC50) đã được quan sát hoặc thu được khi so sánh với nhóm đối chứng. Giá trị này thường thu được từ các nghiên cứu dài hạn về độc tính sinh thái.
Hệ số đánh giá (AFs) được sử dụng để điều chỉnh sự khác biệt giữa dữ liệu thực nghiệm và điều kiện tự nhiên, có tính đến sự khác biệt giữa các lồi và sự khác biệt giữa các chủng trong một loài. Hệ số đánh giá áp dụng cho các thử nghiệm dài hạn thường nhỏ hơn là do sự không đảm bảo của phép ngoại suy từ thực nghiệm đến môi trường tự nhiên được giảm bớt. Càng nhiều dữ liệu cho càng nhiều loài trong cùng một thành phần mơi trường có thể làm giảm tính khơng đảm bảo, vì vậy các hệ số đánh giá sẽ càng giảm hơn nữa.
2.2.5.5. Tính tốn nồng độ dự báo khơng ảnh hưởng trong trầm tích (PNECtt)
Giá trị PNEC trong trầm tích được tính tốn thơng qua giá trị PNEC trong nước và sử dụng phân bố cân bằng. Các cơng thức được sử dụng tính tốn bao gồm:
Giá trị PNECtt được xác định theo công thức [87]
𝐏𝐍𝐄𝐂𝐭𝐭 =𝐊𝐬𝐬−𝐰𝐚𝐭𝐞𝐫
𝐑𝐇𝐎𝐬𝐬 . 𝐏𝐍𝐄𝐂𝐍ướ𝐜. 𝟏𝟎𝟎𝟎 (2.12)