L ời cam đoan
3.3.1.Thành phần Protein của 4 chủng V alginolytics
Dựa theo phương pháp của Laemmli (1970) [47] được bổ sung bởi Tsang và cs (1983) [73] . 5µg mẫu vi khuẩn CH10, CoS01, CoK03 và CoVL03 được ủ trong sample bufer 10% SDS ở 950C trước khi chạy điện di với hiệu điện thế 200V trong 40 phút. Bản gel được nhuộm bạc theo phương pháp của Wray và cs (1981) [80], sau 10 phút quan sát rõ các vạch protein thể hiện qua hình 3.12
Kết quả hình 3.12 cho thấy thành phần protein của 4 chủng V. alginolyticus là tương tự nhau với các vạch protein có khối lượng phân tử lần lượt là 106, 92, 75, 73, 68, 62, 55, 45, 38, 36, 32, 30, 27.5, 16.4 và 15.5 kDa, riêng chủng CH10 không thấy 2 vạch
Hình 3.13. Thành phần protein của 4 chủng V. alginolyticus
16.4 và 15.5 kDa, có thể do lượng vi khuẩn đưa vào ít nên 2 vạch này không quan sát thấy. Theo nghiên cứu của Chuan-fu và cs (2004) đưa ra kết luận protein màng ngoài (OMPs)
có khối lượng phân tử ở 36 kD là protein chính phổ biến trong V. parahaemolyticus và
V. alginolticus [21]. Theo kết quả của Wei-ni và cs (2007) khi phân tích protein của
V. alginolyticus thu từ cá bơn bị bệnh bằng SDS-PAGE cho thấy chủng nghiên cứu đã có 12 vạch protein, trong đó phần lớn protein nằm ở các vạch có khối lượng phân tử là 106, 73, 66, 51, 48, 45, 39, 36 và 32 kDa thể hiện ở 9 vạch đậm hơn trên bản gel và 3 loại protein còn lại có khối lượng phân tử là 92, 82 và 29 kDa. Đồng thời tác giả so sánh với thành phần OMPs của 8 chủng vi khuẩn khác thuộc nhóm Vibrio cũng cho thấy sự tương đồng về thành phần protein, trong đó các protein có khối lượng phân tử 65-105 kDa và 28-48 kD chiếm đa số, đặc biệt protein với khối lượng phân tử 36 kDa được thấy trong tất cả các chủng nghiên cứu [78].
Một nghiên cứu khác của Wei-ni và cs (2008) về cấu trúc của OMPs của 3 chủng vi
khuẩn V.alginolyticus SR1, V.ichthyoenteri HQ010223-1 và V.anguillarum S010610-1 gây bệnh
trên động vật thủy sản, so sánh với 11 chủng vi khuẩn thuộc giống Vibrio và 3 chủng vi khuẩn
thuộc giống khác (Edwardsiella tarda, Pseudomonas fluorescens và Escherichia coli). Kết quả
cho thấy cấu trúc của OMPs 3 chủng là tác nhân gây bệnh trên có 6-12 band protein. OMPs của
các chủng vi khuẩn Vibrio tương tự nhau, trong đó OMP 36 kDa được thấy ở tất cả 14 chủng vi khuẩn Vibrio nghiên cứu nhưng không có mặt ở trong các vi khuẩn thuộc giống khác. Kết quả
nghiên cứuđã khẳngđịnh OMP 36 kDa được sử dụngnhư một dấu hiệu nhận dạng cho các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio [79].
Một nghiên cứu gần đây của Ding và cs (2011) khi so sánh đặc điểm của protein màng ngoài vi khuẩn V. vulnificus và V.alginolyticus cho thấy V. alginolyticus có thành phần OMPs chủ yếu có khối lượng phân tử là 47 kDa, và 38 kDa, ngoài ra có mặt các vạch protein có khối lượng phân tử là 34, 30 và 29 kDa. Kết quả còn đưa ra nhận định protein tương ứng 38 kDa là loại protein có tính kháng nguyên mạnh ở 2 phẩy khuẩn V. vulnificus và V. alginolyticus [25].
Như vậy, thành phần protein vi khuẩn V.alginolyticus gây bệnh trên cá chẽm cũng có mặt các loại protein như các các nghiên cứu trên và hai loại protein chủ yếu là 36 và 38 kDa.
3.3.2. Kết quả phân tích LPS của 4 chủng V. alginolyticus
Dựa theo phương pháp của Tsai và Frasch (1982) [72], sau khi dùng nước cất dừng phản ứng. LPS của 4 chủng V. alginolyticus thể hiện ở hình 3.13:
Từ kết quả nhuộm LPS (hình 3.3.2) ta thấy biểu hiện LPS của 4 chủng nghiên cứu là không đồng nhất, điều này cũng giống với nghiên cứu của Akayli và cs (2008) [10] khi nghiên cứu về LPS của 4 chủng V.alginolyticus gây bệnh trên cá tráp (Sparus aurata) nuôi ở Thổ Nhĩ Kỳ.
Mặc dù chưa có nhiều nghiên cứu về LPS của V. alginolyticus để so sánh đây là phương pháp thích hợp xác định đặc tính kháng nguyên của loài vi khuẩn này.
Chương IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN
4.1. Kết luận
1. Đặc điểm sinh hóa của 4 chủng V. alginolyticus phân lập trên cá chẽm bệnh là tương tự nhau. Các chủng này có đặc điểm gram (-), hình que ngắn, di động, trên môi trường TCBS khuẩn lạc có màu vàng, bóng, lồi, bờ không đều. Trên môi trường TSA, khuẩn lạc có màu trắng sữa, dễ mọc loang. Có thể phát triển tốt nhiệt độ 37oC và ở các nồng độ muối 3%, 7%, 10%, nhưng không mọc trong môi trường muối 0%, nhạy với vibriostat 0/129, dương tính với Oxidase, Catalase, LDC, CIT, IND, GLU, MAN, SOR, SAC, AMY, NO2 nhưng âm tính với ADH, ODC,...
2. Độc lực của 4 chủng V. alginolyticus có sự khác nhau: LD50 của chủng CH10 là CH10 là thấp nhất từ 5,96 x 103 cfu/g sau đó kế tiếp là chủng CoS01 2,84 x 104 cfu/g. Riêng 2 chủng CoK03 và CoVL03 có LD50 ở trên 105 cfu/g. Cá sau khi tiêm vi khuẩn đều có biểu hiện lở loét tại vết tiêm và trên thân, dấu hiệu tương tự như bệnh ngoài tự nhiên. Thời gian xuất hiện bệnh từ 8-15h sau khi tiêm. Tỷ lệ nhiễm bệnh cao nhất ở chủng CH10 và giảm dần ở các chủng CoS01, CoK03 và CoVL03. Cá thí nghiệm ở lô đối chứng khỏe mạnh, ăn nhiều, không có biểu hiện bệnh lở loét và không bị chết trong quá trình thí nghiệm
3. Kết quả phân tích thành phần protein cho thấy 4 chủng V. alginolyticus là tương tự nhau với các band protein có khối lượng phân tử lần lượt là 106, 92, 75, 73, 68, 62, 55, 45, 38, 36, 32, 30, 27.5, 16.4 và 15.5 kDa. Ngoài ra kết quả phân tích LPS cho thấy biểu hiện LPS của 4 chủng nghiên cứu là không đồng nhất.
4.2 Đề xuất ý kiến
1. Cần nghiên cứu so sánh giữa 4 chủng V. alginolyticus nghiên cứu phân lập từ cá chẽm bệnh với chủng V. alginolyticus chuẩn để kết quả tin cậy hơn.
3. Cần có nghiên cứu tiếp theo về các protein của chủng vi khuẩn có tính độc lực cao để làm cơ sở sản xuất vaccine từ vi khuẩn V. alginolyticus phòng bệnh Vibriosis trên cá chẽm nuôi nói riêng và trên cá biển nói chung.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Nguyễn Văn Hảo và Nguyễn Ngọc Du (2005). Tổng quan về các bệnh nguy hiểm thường gặp trên động vật nuôi biển, Báo cáo đề tài khoa học. Viện Nghiên Cứu NTTS II, TP. Hồ Chí Minh.
2. Đỗ Thị Hoà (2003), “ Phương pháp chẩn đoán bệnh do vi khuẩn ở động vật thuỷ sản”. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bài giảng thực hành bệnh vi khuẩn. Trường ĐH Nha Trang, Khánh Hoà.
3. Đỗ Thị Hoà, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng và Nguyễn Thị Muội (2004). Bệnh
học thuỷ sản. NXB Nông Nghiệp, TP. Hồ Chí Minh.
4. Đỗ Thị Hòa, Trần Vĩ Hích, Nguyễn Thị Thùy Giang, Phan Văn Út, Nguyễn Thị Nguyệt Huệ, 2008. Các loại bệnh thường gặp trên các biển nuôi ở Khánh Hòa. Tạp chí Khoa học Công nghệ Thủy sản, số 02, Trường Đại học Nha Trang, trang 16 - 24.
5. Nguyễn Ngọc Nhiên (1992). Sổ tay thí nghiệm bệnh cá vi sinh (dịch từ bảng gốc của J.A. Plumb & P.R. Bower). Bộ thủy sản, Hà Nội.
6. Bùi Quang Tề (1995). Thực hành chuẩn đoán bệnh tôm cá. Viện Nghiên Cứu NTTS I, Bộ Thủy Sản, Hà Nội
7. Nguyễn Thị Thanh Thuỳ (2005). Tìm hiểu bệnh lở loét ở cá mú (Serrranidea) nuôi tại
Khánh Hoà. Luận văn Thạc sĩ, Viện Nghiên Cứu NTTS III, Khánh Hoà.
8. Viên Đại Phúc (2011). Tìm hiểu tác nhân gây bệnh lở loét trên cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi lồng biển tại Nha Trang – Khánh Hòa. Luận văn Thạc sĩ, Viện Nghiên Cứu NTTS III, Khánh Hoà.
Tài liệu tiếng Anh
9. Aguirre-Guzmán G, H. Mejia Ru›z, F. Ascencio (2004). A review of extracellular virulence product of Vibrio species important in diseases of cultivated shrimp. Aquac Res 35:1395–1404.
10.Akayli T., G. Timur, B. Aydemir, A.R. Kiziler, O. Coskun, G. Albayrak và E. Arican (2008). Characterization of Vibrio alginolyticus Isolates from Diseased
Cultured Gilthead Sea Bream, Sparus aurata. The Israeli Journal of Aquaculture – Bamidgeh 60(2), 2008, 89-94.
11.Amel Ben Kahla-Nakbi, K. Chaieb, A. Bakhrouf (2009). Investigation of several virulence properties among Vibrio alginolyticus strains isolated from diseased cultured fish in Tunisia. Diseases of aquatic organisms. Vol. 86: 21–28.
12.Austin B., L.F. Stuckey, A.W. Robertson, I. Effendi và D.R.W. Griffith (1995b).
A probiotic strain of Vibrio alginolyticus effective in reducing diseases caused by Aeromonas salmonicida, Vibrio anguillarum and Vibrio ordalii. J. Fish Dis., 18(1):93-96.
13.Austin B. và D. A. Austin (2007). Bacterial Fish Pathogens. Diseases of Farmed and Wild Fish. Fourth Edition. Springer.
14.Avendan ˜o-Herrera R., J. Rodrı ´guez, B. Magarin ˜os, J.L. Romalde, A.E. Toranzo (2004b). Intraspecific diversity of the marine fish pathogen Tenacibaculum maritimum as determined by randomly amplified polymorphic DNA-PCR. J. Appl. Microbiol. 96, 871–877.
15.Balebona M.C., M.J. Andreu, M.A. Bordas, I. Zorrilla, M.A. Morinigo và J.J. Borrego (1998a). Pathogenicity of Vibrio alginolyticus for cultured gilt-head sea bream (Sparus aurata L.). Appl. Environ. Microbiol., 64(11): 4269-4275.
16.Balebona M. C., I. Zorrilla, M. A. Moriñigo, J. J. Borrego (1998b). Survey of bacterial pathologies affecting farmed gilt-head sea bream (Sparus aurata L.) in southwestern Spain from 1990 to 1996. Aquaculture 166:19–35.
17.Bercovier H., C. Ghittino, A. Eldar (1997). Immunization with bacterial antigens: infections with streptococci and related organisms. In: Gudding, R., Lillehaug, A., Midtlyng, P.J., Brown, F. (Eds.), Fish Vaccinology. Karger, Basel, Switzeland, pp. 153– 160.
18.Bromage E. S., A. Thomas, L. Owens (1999), Streptococcus iniae, a bacterial infection in Barramundi Lates calcarifer.Dis Aqua Org, Vol. 36: 177-181.
19.Cai J. , H. Han, Z. Song, C. Li, J. Zhou (2006). Isolation and characterization of pathogenic Vibrio alginolyticus from diseased postlarval abalone, Haliotis diversicolor supertexta (Lischke). Aquac Res 37:1222–1226.
20.Chen M.F., D. Henry-Ford, J.M. Groff (1995). Isolation of Flexibacter maritimus from California, FHS/AFS Newsl. 22, 7–11.
21.Chuan-fu D., L. Tian-long, X. Bin-fu, G. Hui, L. Neng-feng, (07-2004).
Electrophoretic and immunobot analysis of the major outer membrane protein (MOMP) and polysaccharides antigen(PSA) of Vibrioparaheamolyticus and Vibrio alginolticus. Chinese Journal of Zoonoses. (Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350003,China).
22.Colorni A., I. Paperna và H. Gordin (1981), Bacterial infections in gilt-head sea bream Sparus aurata cultured at Eilat, Aquaculture, 23:25-267.
23.Colorni A., A. Diamant, A. Eldar, H. Kvitt và A. Zlotkin (2002). Streptococcus iniae infections in red seacage-cultured and wild fishes. Dis. Aquat. Org. 49, 165– 170.
24.Devesa S., J.L. Barja, A.E. Toranzo (1989).Ulcerative and skin and fin lesions in reared turbot (Scophthalmus maximus L.). J. Fish Dis. 12, 323–333.
25.Ding T. , L. Tian-long, X. Bin-fu (01- 2011). Comparative Characteristics of Outer Membrane Proteins in Bacteria Vibrio vulnificus and V.alginolyticus. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Fisheries Science (Biotechnology Institute,the Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350003,China).
26.Edward J., M.S. Noga và D.V.M. (2010). Fish disease diagnosis and treatments. Second edition. WILEY-BLACKWELL, A John Wiley & Sons, Inc., Publication, 519 pages.
27.Eldar A., P.F. Frelier, L. Assenta, P.W. Varner, S. Lawhon, H. Bercovier (1995).
Streptococcus shiloi, the name for an agent causing septicemic infection in fish, is a junior synonym of Streptococcus iniae. Int. J. Syst. Bacteriol. 45, 840– 842. 28.Eldar A., S. Perl, P.F. Frelier, H. Bercovier (1999b). Red drum Sciaenops ocellatus
mortalities associated with Streptococcus iniae infection. Dis. Aquat. Org. 36, 121–127.
29.Eldar A. và C. Ghittino (1999). Lactococcus garvieae and Streptococcus iniae infections in rainbow trout Oncorhynchus mykiss: Similar, but different diseases. Disease of Aquatic Organisms 36, 227-231.
30.Esteve C. , E. G. Biosca, C. Amaro (1993). Virulence of Aeromonas hydrophila and some other bacteria isolated from European eels Anguilla anguilla reared in fresh water. Dis Aquat Org 16:15–20.
31.Faddin M.J.F. (1980). Biochemical tests for indentification of medical bacteria, Wiliam & Wilkins, USA.
32.FAO, Cultured Aquatic Species Information Programme: Lates calcarifer (Block , 1790), (on-line), FAO. Truy cập ngày 12/12/2009 tại địa chỉ (http://www.fao.org/fishery/culturedspecies/Lates_calcarifer/en).
33.Frerichs, G.N. (1993), Manual for the isolation and identification of fish bacterial pathogens, Pisces Press-Stirling.
34.Gjerde J., và B. Boe. (1981). Isolation and characterization of Vibrlo alginolyticus and Vibrio parahaemolyticus from the Norwegian coastal environment. Acta Vet. Scand. 22:331-343.
35.Glenn S., J. Bosmans và J. Humphrey (2007). Nothern Territory Barramundi Handbook, 80 pp. (on-line), truy cập ngày 25/12/2009 tại địa chỉ (http://www.nt.gov.au/d/Fisheries/Content/File/NT_Barra_Farming_Handbook_O nline_1107.pdf).
36.Halwart M., D. Soto, J.R. Arthur (2007). Cage aquaculture - Regional reviews and global overview. FAO Fisheries Technical Paper. No. 498. Rome, FAO. 241 pages. 37.Handlinger J., H. Soltani, V. Percival (1997). The pathology of Flexibacter maritimus in aquaculture species of Tasmania, Australia. J. Fish Dis. 20, 159– 168.
38.Hoa T.T.T., D.T.H. Oanh và N.T. Phuong (2001). Characterization and Pathogenicity of Vibrio Bacteria Isolated from Freshwater Prawn (Macrobrachium rosenbergii) Hatcheries, Part 1: Isolation and Identification of
Vibrio spp from Larval Stages.
39.Holt J. G., N. R. Krieg, P. H. A. Sneath, J. T. Staley, S. T. Williams (1994).
Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, Ninth Edition, Williams & Wilkins, 787 pp.
40.Hörmansdorfer S. , H. Wentges, K. Neugebaur-Büchler, J. Bauer (2000).
Isolation of Vibrio alginolyticus from seawater aquaria, International Journal of Hygiene and Environmental Health . Volume 203, Issue 2, Pages 169-175.
41.Jayaprakash N. S. , S. S. Pai, R. Philip, S. B. Singh (2006). Isolation of a pathogenic strain of Vibrio alginolyticus from necrotic larvae of Macrobrachium rosenbergii (de Man). J Fish Dis 29:187–191.
42.Josenhans C. và S. Suerbaum (2002). The role of motility as a virulence factor in bacteria. International Journal of Medical Microbiology. Volume 291, Issue 8, , Pages 605-614.
43.Joseph, S. W., R. R. Colwell, và J. B. Kaper. (1983). Vibrio parahaemolyticus and related halophilic vibrios. Crit. Rev. Microbiol. 10:77-124.
44.Kampelmacher, E. H., L. M. van NoorleJansen, D. A. A. Mossel, và F. J. Groen (1972). A survey of the occurrence of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio alginolyticus on mussels and oysters and in estuarine waters in the Netherlands. J. Appl. Bacteriol. 35:431-438.
45.Kitao T. (1993). Streptococcal infections. In: Inglis, V., Roberts, R.J., Bromage, N.R. (Eds.), Bacterial Diseases of Fish. Blackwell Scientific Publications, Oxford, UK, pp. 196– 210.
46.Kumaran S. , B. Deivasigamani, K. M. Alagappan, M. Sakthivel và S. Guru Prasad (2010). Isolation and characterization of Pseudomonas sp. KUMS3 from Asian sea bass (Lates calcarifer) with fin rot. World Journal of Microbiology and Biotechnology, Volume 26, Number 2, 359-363.
47.Laemmli U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage. T4. Nature (227), pp. 680-685.
48.Lamas J. , I. Santos, D. Bruno , A. E. Toranzo, R. Anderson (1994). A comparison of pathological changes caused by Vibrio anguillarum and its extracellular products in rainbow trout (Oncorynchus mykiss), Fish Pathol 29:79–89.
49.Lee K. K. (1995). Pathogenesis studies on Vibrio alginolyticus in the grouper, Epinephelus malabaricus, Bloch & Schneider. Microbial Pathogenesis 19, 39-48.
50.Lilley J.H, R.B. Callinan, S. Chinabut, S. kanchanakhan, L.H. Macrae và M.J. Phillips. Epizootic Ulcerative Syndrome (EUS) Technical Handbook. Published by DFID. 87pp.
51.Liu P. , J. Lin, P. Hsiao và K. Lee (2004). Isolation and characterization of pathogenic Vibrio alginolyticus from diseased cobia Rachycentron canadum. J. Basic Microbiol. 44 1, 23–28. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
52.Magarin ˜os B., F. Pazos, Y. Santos, J.L. Romalde, A.E. Toranzo (1995), Response of Pasteurella piscicida and Flexibacter maritimus to the skin mucus of marine fish, Dis. Aquat. Org. 21, 103– 108.
53.Molitoris E., S. W. Joseph, M. I. Krichevsky, W. Sindhuhardja và R. R. Colwell (1985). Characterization and Distribution of Vibrio alginolyticus and Vibrio parahaemolyticus Isolated in Indonesia. Applied and Environmental Microbiology, Dec., p. 1388-1394.
54.Narjol G. ,G. M. Blackstone và A. DePaola (2006). Characterization of a Vibrio alginolyticus Strain, Isolated from Alaskan Oysters, Carrying a Hemolysin Gene Similar to the Thermostable Direct Hemolysin-elated emolysin Gene (trh)of Vibrio parahaemolyticus. Applied and Environmental Microbiology, Dec. 2006, p. 7925– 7929 Vol. 72, No. 12.
55.Rajkumar M. , P. Perumal , J. P. Trilles (2005). Cymothoa indica (Crustacea, Isopoda, Cymothoidae) parasitizes the cultured larvae of the Asian seabass Lates calcarifer under laboratory conditions, Dis Aqua Org, Vol. 66: 87-90.
56.Ransangan J. và S. Mustafa (2009). Identification of Vibrio harveyi Isolated from Diseased Asian Seabass Lates calcarifer by Use of 16S Ribosomal DNA Sequencing. Microbiology and Fish Disease Laboratory, Borneo Marine Research Institute, Universiti Malaysia Sabah, 88999 Kota Kinabalu, Sabah, Malaysia. 57.Pazos F., Y. Santos, S. Nu ´n ˜ez, A.E. Toranzo (1993). Increasing occurrence of
Flexibacter maritimus in marine aquaculture of Spain. FHS/AFS Newsl. 21, 1 – 2.
58.Reed L. J. và H. Muench (1938). A simple method of estimating fifty percent endpoints l,2. The American Journal of Hygiene, Vol. 27 May, No. 3 (P. 493 - 497) (Received for publication October 26th, 1937).
59.Renault T., P. Haffner, C. Malfondet và M. Weppeb(1994). Vibrio damsela as a pathogenic agent causing mortalities in culture sea bass (Lates calcarifer). Bull. Eur. Ass. Fish Pathol., 14(4),117.
60.Perera R.P., S.K. Johnson, M.D. Collins, D.H. Lewis (1994). Streptococcus iniae associated with mortality of Tilapia nilotica x T. aurea hybrids. J. Aquat. Anim. Health 6, 335–340.
61.Rimmer M. (2008). Production update – marine finfish aquaculture in the Asia- Pacific region. Asia Aquaculture, Volume XIII No.1 July-September. pp. 46-49. 62.Rimmer M. (2008). Production update – marine finfish aquaculture in the Asia-
Pacific region, Asia Aquaculture,Volume XIII No.3 July-September. pp. 44-46.