Phân lập lại vi khuẩn

L ời cam đoan

2.2.3.3. Phân lập lại vi khuẩn

Dựa trên phương pháp nghiên cứu bệnh vi khuẩn cá và động vật thuỷ sản của Frerichs (1993) [33] , Plumb & Bowser (bản dịch của Nguyễn Ngọc Nhiên,1992 [5]), Bùi Quang Tề (1995) [6] , Đỗ Thị Hòa (2003) [1].

* Môi trường phân lập vi khuẩn:

- Môi trường tổng hợp: TSA + 2% NaCl - Môi trường chọn lọc: TCBS

- Môi trường tăng sinh: TSB + 2% NaCl * Sơ đồ phân lập lại vi khuẩn:

Hình 2.1: Sơ đồ khối phân lập vi khuẩn sau cảm nhiễm

* Nuôi cấy, phân lập lại vi khuẩn Vibrio alginolyticus ở cá thí nghiệm

Thử các phản ứng sinh hóa

Kết luận giống loài vi khuẩn

Phân loại vi khuẩn

Nhuộm gram

Nuôi cấy, phân lập

Cá bệnh ở lô thí nghiệm Hình thái khuẩn lạc Số cá biểu hiện bệnh Tổng số cá tiêm cảm nhiễm x 100% Tỷ lệ biểu hiện bệnh =

 Thu cá có dấu hiệu bỏ ăn, bơi yếu, có hiện tượng tróc vẩy, lở loét tại vùng xung quanh vị trí tiêm và bề mặt cơ thể. Tiến hành mổ cá, dùng que cấy hơ nóng dưới ngọn đèn cồn, để nguội, lấy trực tiếp mẫu bệnh phẩm (ở chỗ vết loét, thận, gan) cấy trên môi trường TCBS, đặt trong tủ ấm 30oC trong 24 giờ.

 Nuôi cấy thuần chủng: chọn khuẩn lạc rời, màu vàng, tròn, lồi, bóng, chiếm ưu thế trên đĩa TCBS, sau đó cấy chuyển sang môi trường TSA 2% NaCl để kiểm tra độ thuần và đủ lượng vi khuẩn để định danh.

 Nhuộm Gram để quan sát hình thái vi khuẩn theo phương pháp của Plumb & Bowser (bản dịch của Nguyễn Ngọc Nhiên, 1992 [5]).

 Định danh lại bằng test API 20E khẳng định là V. alginolyticus

2.2.4. Phương pháp phân tích thành phần protein và lipopolysaccharides (LPS) của vi khuẩn:

Sử dụng kỹ thuật điện di SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) theo phương pháp của Laemmli (1970) [47] được bổ sung bởi (Tsang và cs, 1983 [73]) và nhuộm protein bằng bạc theo phương pháp của Wray và cs (1981) [80] . Bước 1: Rửa tấm kính sau đó lắp kính vào khuôn

Bước 2: Đổ khuôn gel

 Resolving gel: (Dùng cho 2 bản gel)

 Dung dịch nước : 2,96 ml

 Acry 30% : 4,44 ml

 Tris 1,5 : 2,5 ml

 SDS 10% : 0,1 ml

Sau đó cho vào dung dịch trên 5µl TEMED và 50 µl 10%APS. Hỗn hợp gel phải làm nhanh để tránh polyme hóa. Đổ nhẹ nhàng vào khuôn bằng pipet, tránh tạo bọt. Quan sát sự rò rỉ, sau đó phủ lên một lớp nước cất để phá bọt. Chú ý, trước khi đổ gel cần đánh dấu mức đổ gel bằng khoảng cách răng lược. Đợi 45 – 60 phút ở nhiệt độ phòng.

 Stacking gel:

Dung dịch nước :5,55 ml

Acry 30% : 1,85 ml

SDS 10% :0,1 ml

Sau đó cho vào dung dịch trên 10µl TEMED và 50 µl APS. Dùng giấy thấm hút phần nước cất trong khuôn ra, đổ hỗn hợp gel vào khuôn cho ngập phiến kính, cài lược vào khuôn, tránh tạo bọt, đánh dấu vào mỗi răng lược để dễ dàng thao tác khi cho mẫu vào khuôn. Để ở nhiệt độ phòng 30 – 45 phút.

Bước 3: Lắp gel vào khung.

Bước 4: Chuẩn bị electrode buffer:

Pha 100 ml electrode buffer 10X với 900 ml dung dịch nước cất, sau đó đổ vào khuôn điện di (đổ ngập buồng nhỏ của 2 gel)

Bước 5: Chuẩn bị mẫu vi khuẩn và protein chuẩn

Vi khuẩn được nuôi trên môi trường TSA 2% NaCl, sau 24 giờ lấy vi khuẩn hòa trong dung dịch muối PBS để đạt được độ đục khoảng 108 cfu/ml. Đem ly tâm dung dịch vi khuẩn 6000 rpm/4oC trong thời gian 10 phút. Sau khi hút bỏ phần dịch nổi. Tiếp theo pha loãng 2 lần theo tỷ lệ 1:1 bằng dung dịch Sample buffer. Cùng lúc, chuẩn bị protein chuẩn, cũng hòa vào dung dịch Sample buffer với tỷ lệ 1:20. Các mẫu đã chuẩn bị được đem ủ nóng ở 95oC trong 5 phút. Cuối cùng, đổ mẫu vào các giếng trên bản gel 5µl/giếng và chạy điện di ở điện thế 200 V trong 40 phút.

Gel sau khi điện di được nhuộm bạc theo phương pháp của Wray và cs (1981)[80].

2.2.4.1. Phương pháp nhuộn Protein Bước 1: Cố định gel

Gel sau khi được điện di, nhẹ nhàng tách bản gel ra khỏi khuôn cho vào khay có chưa sẵn dung dịch cố định, lắc nhẹ bằng máy lắc trong thời gian 20 phút.

Cách pha dung dịch cố định:

 Methanol: 200ml

 Acid acetic: 40 ml

 Fixative enhancer concentrate: 40 ml

 Dung dịch nước cất : 120 ml

Đổ hết dung dịch cố định vào can đựng nước thải độc hại, sau đó đổ nước cất vào khay, lắc nhẹ trên máy lắc trong 10 phút, rửa 2 lần.

Bước 3: Nhuộm protein

Dung dịch nhuộm dùng cho 2 gel

 Nước cất: 35 ml

 Silver complex solution: 5ml

 Reduction moderator solution: 5ml

 Image development reagen: 5ml

Trộn đều bằng máy khuấy từ, rồi cho thêm vào 50 ml dung dịch Development acclerator solution. Đổ hỗn hợp này vào khay, lắc nhẹ cho đến khi các vạch protein xuất hiện thì dừng phản ứng

Bước 4: Dừng phản ứng

Sau khi các vạch protein xuất hiện rõ, đổ hết dung dịch nhuộm vào can đựng chất thải độc, rồi đổ dung dịch acid acetic 5% để dừng phản ứng nhuộm, lắc nhẹ trong khoảng 15 phút, rửa sạch bằng nước cất trong 5 phút. Sau đó đặt gel lên tấm kính và đưa đi quan sát và chụp hình.

2.2.4.2. Phương pháp nhuộm LPS:

Theo phương pháp của Tsai và Frasch (1982) [72]

Bước 1: Gel sau khi điện di, cố định trong dung dịch cố định LPS, ủ qua đêm ở 4oC Dung dịch cố định LPS (dung dịch A): tính cho 1 gel

 Etanol: 40 ml

 Acetic acid: 5ml

 Nước: 55ml

Bước 2: Gel sau khi ủ qua đêm lấy ra để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, để lên máy lắc rockomat

Chuẩn bị dung dịch oxidase solution (1 gel) dung dịch B

 Periodic acid (H5CO6, M = 227,94 g/mol): 0,7 g

 Fix solution LPS (dung dịch A) : 100 ml Để nhiệt độ phòng 5 phút, lắc đều cho hòa tan.

Bước 3: Đổ hết dung dịch cố định ra thùng chứa nước thải độc, cho dung dịch B vào, để 5 phút.

Bước 4: Đổ hết dung dịch B ra, rửa trong nước 3 lần, mỗi lần 10 phút

Bước 5: Chuẩn bị dung dịch nhuộm LPS (Staining solution) dung dịch C (1gel)

 25% ammoni hydroxide (NH4OH) NH3 trong H2O: 2ml

 0,1M Natri hydroxide (NaOH) : 28 ml

 20% Silver nitrate (AgNO3, M: 169,87 g/mol) : 5ml (giữ trong bóng tối)

 Nước: 115 ml

Bước 6: Đổ hết nước ra, đổ dung dịch C vào để 10 phút

Bước 7: Rửa gel 3 lần, mỗi lần 10 phút trong dung dịch nước

Bước 8: Development solution (dung dịch D)

 37% Formaldehyd: 0,5 ml

 Citric acid : 50mg

 Nước: 1000 ml

Ngâm gel trong dung dịch D cho đến khi các vạch hiện rõ, dừng phản ứng bằng nước cất (rửa ít nhất trong nước 3 lần, mỗi lần 10 phút)

2.3. Phương pháp xử lý số liệu:

Số liệu thí nghiệm xác định LD50 được lý bằng phần mềm Micosoft Office Excel

2003.Cách chia vạch Protein trên bản gel bằng chia theo tỷ lệ dựa vào thang protein chuẩn. Ngoài ra quan sát biểu hiện LPS bằng cảm quan.

Chương III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Đặc điểm sinh hóa và hính thái của 4 chủng V. alginolyticus gây bệnh lở loét trên cá chẽm nuôi lồng bè thương phẩm tại Khánh Hòa. cá chẽm nuôi lồng bè thương phẩm tại Khánh Hòa.

Đặc điểm sinh hóa của 4 chủng V. alginolyticus kiểm tra bằng test API 20E của hãng Bio Mérieux (France) và kết hợp phương pháp truyền thống được thể hiện ở bảng 3.1

Bảng 3.1. Đặc điểm sinh hoá của 4 chủng V. alginolyticus

Các chủng vi khuẩn nghiên cứu

Đặc điểm sinh hóa CH10 CoS01 CoVL03 CoK03

NaCl 0% - - - - 3% + + + + 7% + + + + 10% + + v v Oxidase + + + + Catalase + + + + 0/129 (150 g) + + + + ONPG - - - - ADH - - - - LDC + + + + ODC - - - + CIT + + + + H2S - - - - URE - - - - TDA - - - - IND + + + + VP - - - - GEL - - - + GLU + + + + MAN + + + + INO - - - - SOR + + + +

RHA - - - - SAC + + + + MEL - - - - AMY + + + + ARA - - - - NO2 + + + + Khuẩn lạc trên TCBS Vàng Vàng Vàng Vàng

Ghi chú: -: phản ứng âm tính, +: phản ứng dương tính, v: phản ứng thay đổi trong các lần thử

Qua bảng 3.1 cho thấy các đặc điểm sinh hóa của 4 chủng V. alginolyticus phân lập được đều tương tự nhau. Do có đặc điểm giống với đặc điểm mô tả của Holt và cs (1994) [39], Balebona và cs (1998a) [15]. Các chủng này có đặc điểm gram (-), hình que ngắn, di động; trên môi trường TCBS: khuẩn lạc có màu vàng, bóng, lồi, bờ không đều; trên môi trường TSA: khuẩn lạc có màu trắng sữa, dễ mọc loang. Các chủng đều có thể phát triển tốt nhiệt độ 37oC và ở các nồng độ muối 3%, 7%, 10%, nhưng không mọc được trong môi trường muối 0%; nhạy với vibriostat 0/129 (150 g); dương tính với Oxidase, Catalase, LDC, CIT, IND, GLU, MAN, SOR, SAC, AMY, NO2 nhưng âm tính với ADH, ODC,....Theo các nghiên cứu của Đỗ Thị Hoà và cs (2004) [3], Nguyễn Thị Thanh Thuỳ (2005) [7], Austin và cs (2007) [13], Viên Đại Phúc (2011) [8] cũng cho kết quả tương tự. Cả 4 chủng V. alginolyticus đều có khả năng chịu đựng muối ở nồng độ 10%, tuy nhiên 2 chủng CoVL03 và CoK03 kém phát triển trong NaCl 10% hơn so với 2 chủng còn lại. Theo kết quả của Narjol và cs (2006), chủng V. alginolyticus ATCC 33787 có thể phát triển được ở 10% NaCl và ở nhiệt độ từ 20 – 40oC; điều này cũng trùng với kết quả của Gjerde và Boe (1981), V. alginolyticus phát triển phong phú ở vùng biển nước ấm[54], [34]. Theo nghiên cứu của Molitoris và cs (1985), khi nghiên cứu 340 chủng V. alginolyticus phân lập từ nước biển, mẫu hải sản tươi từ chợ ở Jakarta ở Indonexia cho thấy 78,5% các chủng phát triển được ở nồng độ muối 10% [53]. Hoa T.T.T và cs (2001) khi nghiên cứu đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn V. alginolyticus cũng khẳng định nó có khả năng phát triển trong muối 10% [38].

Hình 3.1: Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn V. alginolyticus trên test kit API - 20E

Hình 3.2: Đặc điểm hình thái vi khuẩn V. alginolyticus trên môi trường TCBS và nhuộm Gram

3.2 Kết quả kiểm tra độc lực của 4 chủng V. alginolyticus (Đợt 1)

Cá thí nghiệm:

Chiều dài: 11,9 ± 0,27 (mm)

Khối lượng: 19,5 ± 1,06 (g)

Điều kiện thí nghiệm:

Độ mặn: 33-35 ‰ Nhiệt độ: 27-28oC pH: 7.7-7.9

Sau 10 ngày theo dõi thí nghiệm, kết quả kiểm tra độc lực của 4 chủng vi khuẩn

V. alginolyticus đợt 1 từ ngày 29/07/2010 đến ngày 07/08/2010 như sau:

3.2.1 Kết quả kiểm tra độc lực chủng CH10

Sau khi tiêm xong, cá bơi lội bình thường. Thời gian dấu hiệu bệnh xuất hiện đầu tiên ở lô 105, 104, 103 và 102 cfu/g cá lần lượt là 10, 12, 13 và 15 giờ với tỷ lệ biểu hiện tương ứng là 100%, 100%, 60% và 20%. Cá ít hoạt động, vùng mô cơ và da chỗ vết tiêm bị sưng phồng, đỏ. Sau 15h, kích thước vùng tiêm bị sưng phồng có sự khác nhau ở các nồng độ tiêm, cụ thể kích thước vết sưng là: 2-3 x 1-1,5; 2-2,5 x 1-1,2; 1,8- 2,2 x 0,8-1 và 1-1,5 x 0,5 cm tương ứng với các nồng độ 105, 104, 103 và 102 cfu/g. Như vậy ở nồng độ càng cao hiểu hiện bệnh càng rõ ràng, vùng vết tiêm sưng, phồng bị lan rộng và đỏ bầm. Vết tiêm ngày càng sưng to và lở loét ra xung quanh.

Ở nồng độ tiêm 105 cfu/g, cá chết nhanh trong 4 ngày đầu, tỷ lệ chết tích lũy là 60%. Cá còn sống sau 3 ngày thí nghiệm có biểu hiện vẩy ở vùng tiêm bị tróc. Cá còn sống sau 4 ngày tiêm, bị tróc hết vẩy phần vùng tiêm và phần cơ thịt bị loét ra có màu trắng, có con xuất hiện biểu hiện lở loét ở ngoài vùng tiêm, vị trí biểu hiện ở vùng cơ gần cuống đuôi và phần cơ thịt ngay bên phải vây hậu môn bị sưng đỏ. Cá sau 5 ngày tiêm, con bị lở loét gần cuống đuôi có thêm biểu hiện tróc vẩy, mòn đuôi. Sau 6 ngày tiêm tỷ lệ chết tích lũy lên tới 90%. Cá còn lại bị tróc phần khối thịt loét màu trắng và có dấu hiệu

Hình 3.4: Độc lực chủng CH10 trên cá chẽm khỏe; a: Tỷ lệ chết tích lũy (%)

và b: tỷ lệ biểu hiện bệnh (%). b CHỦNG CH10 (LẦN 1) 0 20 40 60 80 100 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240

Thời gian (giờ)

T ỷ l ệ c h ế t tí c h l ũ y ( % ) 10^5 10^4 10^3 10^2 ĐC CHỦNG CH10 (LẦN 1) 0 20 40 60 80 100 120 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240

Thời gian (giờ)

T ỷ l ệ b iể u h iệ n b ện h ( % ) 10^5 10^4 10^3 10^2 ĐC a LD50 =6,31 x 103 cfu/g

lành vết loét sau 10 ngày tiêm. Ngoài biểu hiện bệnh lở loét, cá bỏ ăn trong suốt thời gian thí nghiệm, thải phân màu trắng.

Đối với lô thí nghiệm 104 cfu/g, sau khi tiêm 12 giờ cá có biểu hiện sưng đỏ tại vùng tiêm với tỷ lệ 100%, cá chết nhanh sau khi tiêm từ 3 đến 6 ngày, tỷ lệ chết tích lũy sau 6 ngày là 60%, sau đó cá không chết. Tương tự như nồng độ tiêm ở 105 cfu/g, cá sau khi tiêm 3 ngày, vùng xung quanh vết tiêm sưng, đỏ đậm, vết sưng lan rộng ra và có hiện tượng tróc vẩy. Sau 4 ngày tiêm, phần vẩy ở vùng tiêm bị tróc hết, để lộ phần thịt bị lở loét, màu trắng. Ngoài ra xuất hiện cá bị sưng ngoài vùng tiêm, vị trí ở dưới vết tiêm và trên vây hậu môn. Đến ngày thứ 6 có cá có cá bị biểu hiện tróc vẩy vùng cuống đuôi và mòn đuôi. Cá sau khi tiêm 7 ngày có hiện tượng bong tróc phần khối thịt trắng chỗ vết tiêm, nhưng cá này sau đó có dấu hiệu phục hồi. Ngoài biểu hiện bệnh lở loét, trong 5 ngày đầu sau khi tiêm cá bỏ ăn và thải phân màu trắng dưới đáy bể, sau đó những con còn sống ăn ít.

Ở lô tiêm nồng độ 103 cfu/g, sau khi tiêm 13 giờ, cá có biểu hiện sưng, phồng, đỏ chỗ vùng tiêm với tỷ lệ 60%. Tuy nhiên mức độ biểu hiện bệnh nhẹ hơn so với lô tiêm ở nồng độ 105 và 104 cfu/g. Cá sau khi tiêm 3 ngày tỷ lệ biểu hiện bệnh lở loét là 50%, vết loét không bị lan rộng và tróc vẩy ít. Sau 5 ngày tiêm cá ăn khỏe. Cá bị loét có dấu hiệu phục hồi, đến ngày thứ 8 tỷ lệ biểu hiện bệnh còn 20%, ở mức độ nhẹ. Tỷ lệ chết tích lũy sau 10 ngày thí nghiệm là 10%.

Ở nồng độ 102 cfu/g không gây chết cho cá. Tuy nhiên có biểu hiện bệnh lở loét, sau khi tiêm 15 giờ thấy 20% cá có biểu hiện chỗ vết tiêm bị sưng, đỏ nhẹ, tuy nhiên sang ngày thứ 2 thì hết sưng, không lan rộng ra. Sau 3 ngày tiêm, chỗ vết tiêm bị tróc ít vẩy, cá ăn khỏe. Sau 6 ngày thí nghiệm cá đã phục hồi lại, không còn biểu hiện bệnh lở loét, cá hoạt động bình thường ăn khỏe.

3.2.2 Kết quả kiểm tra độc lực chủng CoS01

Tương tự giống với kết quả kiểm tra độc lực của chủng CH10. Đối với chủng CoS01, cá sau khi tiêm cũng bơi lội bình thường. Tuy nhiên, thời gian xuất hiện bệnh sớm hơn chủng CH10 và tỷ lệ biểu hiện bệnh cũng cao. Thời gian dấu hiệu bệnh xuất hiện đầu tiên ở lô 105, 104, 103 và 102 cfu/g cá lần lượt là 8, 9, 10 và 14 giờ với tỷ lệ biểu hiện tương ứng là 100%, 100%, 30% và 40%. Cá có biểu hiện ít hoạt động, vùng mô cơ và da cho vết tiêm bị sưng, phồng và đỏ bầm. Kích thước vùng tiêm bị sưng phồng sau 14h tiêm vi khuẩn ở nồng độ 105, 104, 103 và 102 cfu/g cũng có sự khác biệt tương tự với chủng CH10 và tương ứng là 2-3 x 1-1,5; 2-2,5 x 1-1,3; 1,5- 2,0 x 0,8-1 và 1-1,2 x 0,3-0,5 cm. Ở nồng độ tiêm vi khuẩn cao 105, 104 cfu/g hiểu hiện bệnh rõ ràng, vùng vết tiêm sưng, phồng và đỏ bầm bị lan rộng. Vết tiêm ngày càng sưng to và lở loét ra xung quanh. Ở

Hình 3.5: Biểu hiện cá bị bệnh lở loét khi tiêm chủng vi khuẩn CH10

Hình 3.6. Độc lực chủng CoS01 trên cá chẽm khỏe; a: Tỷ lệ chết tích lũy (%) và b:

tỷ lệ biểu hiện bệnh (%). CHỦNG CoS01 (LẦN 1) 0 20 40 60 80 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240

Thời gian (giờ)

T ỷ l ệ ch ết t ích l ũ y ( % ) 10^5