L ời cam đoan
2.2.4.2. Phương pháp nhuộm LPS
Theo phương pháp của Tsai và Frasch (1982) [72]
Bước 1: Gel sau khi điện di, cố định trong dung dịch cố định LPS, ủ qua đêm ở 4oC Dung dịch cố định LPS (dung dịch A): tính cho 1 gel
Etanol: 40 ml
Acetic acid: 5ml
Nước: 55ml
Bước 2: Gel sau khi ủ qua đêm lấy ra để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, để lên máy lắc rockomat
Chuẩn bị dung dịch oxidase solution (1 gel) dung dịch B
Periodic acid (H5CO6, M = 227,94 g/mol): 0,7 g
Fix solution LPS (dung dịch A) : 100 ml Để nhiệt độ phòng 5 phút, lắc đều cho hòa tan.
Bước 3: Đổ hết dung dịch cố định ra thùng chứa nước thải độc, cho dung dịch B vào, để 5 phút.
Bước 4: Đổ hết dung dịch B ra, rửa trong nước 3 lần, mỗi lần 10 phút
Bước 5: Chuẩn bị dung dịch nhuộm LPS (Staining solution) dung dịch C (1gel)
25% ammoni hydroxide (NH4OH) NH3 trong H2O: 2ml
0,1M Natri hydroxide (NaOH) : 28 ml
20% Silver nitrate (AgNO3, M: 169,87 g/mol) : 5ml (giữ trong bóng tối)
Nước: 115 ml
Bước 6: Đổ hết nước ra, đổ dung dịch C vào để 10 phút
Bước 7: Rửa gel 3 lần, mỗi lần 10 phút trong dung dịch nước
Bước 8: Development solution (dung dịch D)
37% Formaldehyd: 0,5 ml
Citric acid : 50mg
Nước: 1000 ml
Ngâm gel trong dung dịch D cho đến khi các vạch hiện rõ, dừng phản ứng bằng nước cất (rửa ít nhất trong nước 3 lần, mỗi lần 10 phút)
2.3. Phương pháp xử lý số liệu:
Số liệu thí nghiệm xác định LD50 được lý bằng phần mềm Micosoft Office Excel
2003.Cách chia vạch Protein trên bản gel bằng chia theo tỷ lệ dựa vào thang protein chuẩn. Ngoài ra quan sát biểu hiện LPS bằng cảm quan.
Chương III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Đặc điểm sinh hóa và hính thái của 4 chủng V. alginolyticus gây bệnh lở loét trên cá chẽm nuôi lồng bè thương phẩm tại Khánh Hòa. cá chẽm nuôi lồng bè thương phẩm tại Khánh Hòa.
Đặc điểm sinh hóa của 4 chủng V. alginolyticus kiểm tra bằng test API 20E của hãng Bio Mérieux (France) và kết hợp phương pháp truyền thống được thể hiện ở bảng 3.1
Bảng 3.1. Đặc điểm sinh hoá của 4 chủng V. alginolyticus
Các chủng vi khuẩn nghiên cứu
Đặc điểm sinh hóa CH10 CoS01 CoVL03 CoK03
NaCl 0% - - - - 3% + + + + 7% + + + + 10% + + v v Oxidase + + + + Catalase + + + + 0/129 (150 g) + + + + ONPG - - - - ADH - - - - LDC + + + + ODC - - - + CIT + + + + H2S - - - - URE - - - - TDA - - - - IND + + + + VP - - - - GEL - - - + GLU + + + + MAN + + + + INO - - - - SOR + + + +
RHA - - - - SAC + + + + MEL - - - - AMY + + + + ARA - - - - NO2 + + + + Khuẩn lạc trên TCBS Vàng Vàng Vàng Vàng
Ghi chú: -: phản ứng âm tính, +: phản ứng dương tính, v: phản ứng thay đổi trong các lần thử
Qua bảng 3.1 cho thấy các đặc điểm sinh hóa của 4 chủng V. alginolyticus phân lập được đều tương tự nhau. Do có đặc điểm giống với đặc điểm mô tả của Holt và cs (1994) [39], Balebona và cs (1998a) [15]. Các chủng này có đặc điểm gram (-), hình que ngắn, di động; trên môi trường TCBS: khuẩn lạc có màu vàng, bóng, lồi, bờ không đều; trên môi trường TSA: khuẩn lạc có màu trắng sữa, dễ mọc loang. Các chủng đều có thể phát triển tốt nhiệt độ 37oC và ở các nồng độ muối 3%, 7%, 10%, nhưng không mọc được trong môi trường muối 0%; nhạy với vibriostat 0/129 (150 g); dương tính với Oxidase, Catalase, LDC, CIT, IND, GLU, MAN, SOR, SAC, AMY, NO2 nhưng âm tính với ADH, ODC,....Theo các nghiên cứu của Đỗ Thị Hoà và cs (2004) [3], Nguyễn Thị Thanh Thuỳ (2005) [7], Austin và cs (2007) [13], Viên Đại Phúc (2011) [8] cũng cho kết quả tương tự. Cả 4 chủng V. alginolyticus đều có khả năng chịu đựng muối ở nồng độ 10%, tuy nhiên 2 chủng CoVL03 và CoK03 kém phát triển trong NaCl 10% hơn so với 2 chủng còn lại. Theo kết quả của Narjol và cs (2006), chủng V. alginolyticus ATCC 33787 có thể phát triển được ở 10% NaCl và ở nhiệt độ từ 20 – 40oC; điều này cũng trùng với kết quả của Gjerde và Boe (1981), V. alginolyticus phát triển phong phú ở vùng biển nước ấm[54], [34]. Theo nghiên cứu của Molitoris và cs (1985), khi nghiên cứu 340 chủng V. alginolyticus phân lập từ nước biển, mẫu hải sản tươi từ chợ ở Jakarta ở Indonexia cho thấy 78,5% các chủng phát triển được ở nồng độ muối 10% [53]. Hoa T.T.T và cs (2001) khi nghiên cứu đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn V. alginolyticus cũng khẳng định nó có khả năng phát triển trong muối 10% [38].
Hình 3.1: Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn V. alginolyticus trên test kit API - 20E
Hình 3.2: Đặc điểm hình thái vi khuẩn V. alginolyticus trên môi trường TCBS và nhuộm Gram
3.2 Kết quả kiểm tra độc lực của 4 chủng V. alginolyticus (Đợt 1)
Cá thí nghiệm:
Chiều dài: 11,9 ± 0,27 (mm)
Khối lượng: 19,5 ± 1,06 (g)
Điều kiện thí nghiệm:
Độ mặn: 33-35 ‰ Nhiệt độ: 27-28oC pH: 7.7-7.9
Sau 10 ngày theo dõi thí nghiệm, kết quả kiểm tra độc lực của 4 chủng vi khuẩn
V. alginolyticus đợt 1 từ ngày 29/07/2010 đến ngày 07/08/2010 như sau:
3.2.1 Kết quả kiểm tra độc lực chủng CH10
Sau khi tiêm xong, cá bơi lội bình thường. Thời gian dấu hiệu bệnh xuất hiện đầu tiên ở lô 105, 104, 103 và 102 cfu/g cá lần lượt là 10, 12, 13 và 15 giờ với tỷ lệ biểu hiện tương ứng là 100%, 100%, 60% và 20%. Cá ít hoạt động, vùng mô cơ và da chỗ vết tiêm bị sưng phồng, đỏ. Sau 15h, kích thước vùng tiêm bị sưng phồng có sự khác nhau ở các nồng độ tiêm, cụ thể kích thước vết sưng là: 2-3 x 1-1,5; 2-2,5 x 1-1,2; 1,8- 2,2 x 0,8-1 và 1-1,5 x 0,5 cm tương ứng với các nồng độ 105, 104, 103 và 102 cfu/g. Như vậy ở nồng độ càng cao hiểu hiện bệnh càng rõ ràng, vùng vết tiêm sưng, phồng bị lan rộng và đỏ bầm. Vết tiêm ngày càng sưng to và lở loét ra xung quanh.
Ở nồng độ tiêm 105 cfu/g, cá chết nhanh trong 4 ngày đầu, tỷ lệ chết tích lũy là 60%. Cá còn sống sau 3 ngày thí nghiệm có biểu hiện vẩy ở vùng tiêm bị tróc. Cá còn sống sau 4 ngày tiêm, bị tróc hết vẩy phần vùng tiêm và phần cơ thịt bị loét ra có màu trắng, có con xuất hiện biểu hiện lở loét ở ngoài vùng tiêm, vị trí biểu hiện ở vùng cơ gần cuống đuôi và phần cơ thịt ngay bên phải vây hậu môn bị sưng đỏ. Cá sau 5 ngày tiêm, con bị lở loét gần cuống đuôi có thêm biểu hiện tróc vẩy, mòn đuôi. Sau 6 ngày tiêm tỷ lệ chết tích lũy lên tới 90%. Cá còn lại bị tróc phần khối thịt loét màu trắng và có dấu hiệu
Hình 3.4: Độc lực chủng CH10 trên cá chẽm khỏe; a: Tỷ lệ chết tích lũy (%)
và b: tỷ lệ biểu hiện bệnh (%). b CHỦNG CH10 (LẦN 1) 0 20 40 60 80 100 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240
Thời gian (giờ)
T ỷ l ệ c h ế t tí c h l ũ y ( % ) 10^5 10^4 10^3 10^2 ĐC CHỦNG CH10 (LẦN 1) 0 20 40 60 80 100 120 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240
Thời gian (giờ)
T ỷ l ệ b iể u h iệ n b ện h ( % ) 10^5 10^4 10^3 10^2 ĐC a LD50 =6,31 x 103 cfu/g
lành vết loét sau 10 ngày tiêm. Ngoài biểu hiện bệnh lở loét, cá bỏ ăn trong suốt thời gian thí nghiệm, thải phân màu trắng.
Đối với lô thí nghiệm 104 cfu/g, sau khi tiêm 12 giờ cá có biểu hiện sưng đỏ tại vùng tiêm với tỷ lệ 100%, cá chết nhanh sau khi tiêm từ 3 đến 6 ngày, tỷ lệ chết tích lũy sau 6 ngày là 60%, sau đó cá không chết. Tương tự như nồng độ tiêm ở 105 cfu/g, cá sau khi tiêm 3 ngày, vùng xung quanh vết tiêm sưng, đỏ đậm, vết sưng lan rộng ra và có hiện tượng tróc vẩy. Sau 4 ngày tiêm, phần vẩy ở vùng tiêm bị tróc hết, để lộ phần thịt bị lở loét, màu trắng. Ngoài ra xuất hiện cá bị sưng ngoài vùng tiêm, vị trí ở dưới vết tiêm và trên vây hậu môn. Đến ngày thứ 6 có cá có cá bị biểu hiện tróc vẩy vùng cuống đuôi và mòn đuôi. Cá sau khi tiêm 7 ngày có hiện tượng bong tróc phần khối thịt trắng chỗ vết tiêm, nhưng cá này sau đó có dấu hiệu phục hồi. Ngoài biểu hiện bệnh lở loét, trong 5 ngày đầu sau khi tiêm cá bỏ ăn và thải phân màu trắng dưới đáy bể, sau đó những con còn sống ăn ít.
Ở lô tiêm nồng độ 103 cfu/g, sau khi tiêm 13 giờ, cá có biểu hiện sưng, phồng, đỏ chỗ vùng tiêm với tỷ lệ 60%. Tuy nhiên mức độ biểu hiện bệnh nhẹ hơn so với lô tiêm ở nồng độ 105 và 104 cfu/g. Cá sau khi tiêm 3 ngày tỷ lệ biểu hiện bệnh lở loét là 50%, vết loét không bị lan rộng và tróc vẩy ít. Sau 5 ngày tiêm cá ăn khỏe. Cá bị loét có dấu hiệu phục hồi, đến ngày thứ 8 tỷ lệ biểu hiện bệnh còn 20%, ở mức độ nhẹ. Tỷ lệ chết tích lũy sau 10 ngày thí nghiệm là 10%.
Ở nồng độ 102 cfu/g không gây chết cho cá. Tuy nhiên có biểu hiện bệnh lở loét, sau khi tiêm 15 giờ thấy 20% cá có biểu hiện chỗ vết tiêm bị sưng, đỏ nhẹ, tuy nhiên sang ngày thứ 2 thì hết sưng, không lan rộng ra. Sau 3 ngày tiêm, chỗ vết tiêm bị tróc ít vẩy, cá ăn khỏe. Sau 6 ngày thí nghiệm cá đã phục hồi lại, không còn biểu hiện bệnh lở loét, cá hoạt động bình thường ăn khỏe.
3.2.2 Kết quả kiểm tra độc lực chủng CoS01
Tương tự giống với kết quả kiểm tra độc lực của chủng CH10. Đối với chủng CoS01, cá sau khi tiêm cũng bơi lội bình thường. Tuy nhiên, thời gian xuất hiện bệnh sớm hơn chủng CH10 và tỷ lệ biểu hiện bệnh cũng cao. Thời gian dấu hiệu bệnh xuất hiện đầu tiên ở lô 105, 104, 103 và 102 cfu/g cá lần lượt là 8, 9, 10 và 14 giờ với tỷ lệ biểu hiện tương ứng là 100%, 100%, 30% và 40%. Cá có biểu hiện ít hoạt động, vùng mô cơ và da cho vết tiêm bị sưng, phồng và đỏ bầm. Kích thước vùng tiêm bị sưng phồng sau 14h tiêm vi khuẩn ở nồng độ 105, 104, 103 và 102 cfu/g cũng có sự khác biệt tương tự với chủng CH10 và tương ứng là 2-3 x 1-1,5; 2-2,5 x 1-1,3; 1,5- 2,0 x 0,8-1 và 1-1,2 x 0,3-0,5 cm. Ở nồng độ tiêm vi khuẩn cao 105, 104 cfu/g hiểu hiện bệnh rõ ràng, vùng vết tiêm sưng, phồng và đỏ bầm bị lan rộng. Vết tiêm ngày càng sưng to và lở loét ra xung quanh. Ở
Hình 3.5: Biểu hiện cá bị bệnh lở loét khi tiêm chủng vi khuẩn CH10
Hình 3.6. Độc lực chủng CoS01 trên cá chẽm khỏe; a: Tỷ lệ chết tích lũy (%) và b:
tỷ lệ biểu hiện bệnh (%). CHỦNG CoS01 (LẦN 1) 0 20 40 60 80 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240
Thời gian (giờ)
T ỷ l ệ ch ết t ích l ũ y ( % ) 10^5 10^4 10^3 10^2 ĐC b a CHỦNG CoS01 (LẦN 1) 0 20 40 60 80 100 120 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 Thời gian (giờ)
T ỷ l ệ b iể u h iệ n b ện h ( % ) 10^5 10^4 10^3 10^2 ĐC LD50 = 3,16 x 104
nồng độ thấp hơn chỗ vết tiêm cùng bị sưng, phồng và đỏ nhưng tỷ lệ con bị thấp hơn, vết sưng cũng nhỏ hơn.
Ở nồng độ tiêm 105 cfu/g, biểu hiện cá bị bệnh xuất hiện sớm, sau 8 giờ sau khi tiêm vi khuẩn. Tuy nhiên, cá chết rải rác trong 10 ngày thí nghiệm, tỷ lệ chết tích lũy là 70%. Sau 48h tiêm mới có cá chết đầu tiên, vùng vết tiêm sưng có hiện tượng mưng mủ. Cá còn sống sau 72h biểu hiện vẩy ở vùng tiêm bị tróc. Cá còn sống sau 4 ngày tiêm, bị tróc hết vẩy phần vùng tiêm và phần cơ thịt bị loét ra có màu trắng, có cá bị biểu hiện sưng đỏ nhẹ ở vùng cơ gần cuống đuôi. Cá sau 5 ngày tiêm, có con bị tróc khối thịt thối màu trắng chỗ vết tiêm, con bị sưng đỏ vùng cuống đuôi có thêm biểu hiện mòn và xơ đuôi. Cá sau 7 ngày tiêm, có con có dấu hiệu phục hồi, vết loét tạo thành khối thịt thối màu trắng bị bong ra. Ngoài biểu hiện bệnh lở loét, cá bỏ ăn trong suốt thời gian thí nghiệm, thải phân màu trắng.
Đối với lô thí nghiệm 104 cfu/g, sau khi tiêm vi khuẩn 9 giờ cá có biểu hiện sưng, phồng và đỏ bầm tại vùng tiêm với tỷ lệ 100%. Cá chết sau 72 giờ tiêm, tỷ lệ chết tích lũy đến ngày thứ 6 là 30%, sau đó cá không chết cho đến khi kết thúc thí nghiệm. Tương tự như nồng độ tiêm ở 105 cfu/g, cá sau khi tiêm 2 ngày viết tiêm sưng và bị mưng mủ, sau 3 ngày tiêm vùng xung quanh vết tiêm sưng, đỏ đậm, vết sưng lan rộng ra và có hiện tượng tróc vẩy, loét. Sau 4 ngày tiêm, phần vẩy ở vùng tiêm bị tróc hết, để lộ phần thịt bị lở loét, màu trắng. Có con bị tróc phần khối thịt thối màu trắng ra khỏi cơ thể. Sang ngày thứ 5 xuất hiện cá bị sưng ngoài vùng tiêm, vị trí ở vùng cơ gần cuống đuôi bên phải. Cá sau khi tiêm 7 ngày có hiện tượng bong tróc phần khối thịt thối màu trắng chỗ vết tiêm, những con cá này sau đó có dấu hiệu phục hồi. Cá bị sưng ngoài vết tiêm không biểu hiện nặng hơn. Ngoài biểu hiện bệnh lở loét, trong 3 ngày đầu sau khi tiêm cá bỏ ăn và thải phân màu trắng dưới đáy bể, sau đó những con còn sống ăn ít và duy trì đến khi kết thúc thí nghiệm.
Ở lô tiêm nồng độ 103 cfu/g, sau khi tiêm 10 giờ, cá có biểu hiện sưng, phồng, đỏ chỗ vùng tiêm tuy nhiên với tỷ lệ thấp 30%. Mức độ biểu hiện bệnh nhẹ hơn so với lô tiêm ở nồng độ 105 và 104 cfu/g. Cá sau khi tiêm 6 ngày tỷ lệ biểu hiện bệnh lở loét còn 20%, vết loét không bị lan rộng và có dấu hiệu phục hồi. Sau 4 ngày tiêm cá ăn khỏe. Không có cá bị chết trong quá trình thí nghiệm.
Ở nồng độ 102 cfu/g cũng không gây chết cho cá. Tuy nhiên có biểu hiện bệnh lở loét sau khi tiêm 14 giờ với tỷ lệ 40%. Sang ngày thứ 2, chỗ vết tiêm sưng rộng ra nhưng ít. Có con biểu hiện nhẹ thì hết sưng, không lan rộng ra. Sau 3 ngày tiêm, chỗ vết tiêm bị tróc ít vẩy, cá ăn khỏe. Sau 8 ngày thí nghiệm cá đã phục hồi lại chỉ còn 10% loét nhẹ, các con khác không còn biểu hiện bệnh lở loét, cá hoạt động bình thường ăn khỏe.
Từ kết quả trên, ta tính được LD50 lần 1 của chủng CoS01 là 3,16 x104 cfu/g cá.
3.2.3 Kết quả kiểm tra độc lực chủng CoK03.
Cá hoạt động bình thường sau khi tiêm xong. Thời gian dấu hiệu bệnh xuất hiện đầu tiên chậm hơn so với 2 chủng vi khuẩn CH10 và CoS01, ở lô 105, 104 và 103 cfu/g cá lần lượt là 20, 24, 30 giờ với tỷ lệ biểu hiện tương ứng là 80%, 40% và 20%. Cá có biểu hiện vùng mô cơ và da chỗ vết tiêm bị sưng, phồng và đỏ bầm.
Ở nồng độ 105 cfu/g cá ăn ít, sang ngày thứ 3 biểu hiện bệnh lở loét là 100%, tuy nhiên ở mức độ nhẹ, sang ngày thứ 5 chỗ vết loét bị lan rộng ra, sang ngày thứ 7 có con bị tróc khối thịt thối màu trắng chỗ vết tiêm và có dấu hiệu phục hồi, sau 10 ngày thí nghiệm tỷ lệ loét chỉ 50% và ở mức độ nhẹ, gần khỏi.
Ở nồng độ 104 cfu/g, sau khi tiêm 5 ngày tỷ lệ bệnh lở loét là 60%, tuy nhiên ở mức độ nhẹ, vết loét không bị lan rộng, sang ngày thứ 6 có con bị bong tróc khối thịt thối màu trắng chỗ vết tiêm và có dấu hiệu phục hồi, khi kết thúc thí nghiệm tỷ lệ lở loét còn 20% ở mực độ nhẹ, gần khỏi bệnh. Cá hoạt động bình thường, ăn khỏe.