L ời cam đoan
3.2.5. Kết quả phân lập trở lại V.alginolyticus
Cá thí nghiệm sau khi có các dấu hiệu bệnh đặc trưng của bệnh lở loét như bơi yếu, lở loét thân, xuất huyết, ăn ít và thải phân trắng sẽ được thu mẫu và tiến hành giải phẫu để nuôi cấy phân lập và định danh vi khuẩn. Các mẫu cá bệnh đem giải phẫu đều thấy biểu hiện gan sưng, sậm màu; thận sậm màu; tích dịch trong xoang bụng. Lấy mẫu bệnh phẩm ở gan, thận và vết loét chúng tôi phân lập trên môi trường TCBS được một loại khuẩn lạc màu vàng, lồi, bề mặt bóng, bờ không đều, đường kính 1.5 mm, thuần chủng. Sau khi cấy thuần trên môi trường TSA 2% NaCl và tiến hành thử các phản ứng sinh hóa thì cho ra kết quả tương tự như bảng 3.1. Kết luận vi khuẩn phân lập lại được chính là Vibrio alginolyticus.
Hình 3.10. Biểu hiện cá bị bệnh khi tiêm kiểm tra độc lực vi khuẩn
V. alginolyticus và cá khỏe mạnh ở lô đối chứng
3.2.6. Kết quả kiểm tra độc lực 4 chủng vi khuẩn V. alginolyticus (đợt 2)
Thí nghiệm kiểm tra độc lực 4 chủng vi khuẩn V. alginolyticus đợt 2 diễn ra từ ngày 27/08/2010 đến ngày 05/09/2010:
Cá thí nghiệm:
Chiều dài: 13,9 ± 0,41 (mm)
Khối lượng: 21,9 ± 0,96 (g)
Điều kiện thí nghiệm:
Độ mặn: 33-35 ‰ Nhiệt độ: 27-28oC pH: 7.7-7.9
Sau 10 ngày theo dõi, kết quả thí nghiệm đợt 2 cũng tương tự với thí nghiệm đợt 1. Hai chủng CH10 và CoS01 có giá trị LD50 lần lượt là 5,62 x 103 và 2,51 x 104 cfu/g cá, hai
chủng CoK03 và CoVL03 chưa tính được LD50.
Qua biểu đồ 3.2.6, thấy rằng hai chủng CH10 và CoS01 gây tỷ lệ chết tích lũy tăng dần theo nồng độ vi khuẩn đem tiêm, tỷ lệ biểu hiện bệnh lở loét là 100% ở nồng độ tiêm 104 và 105 cfu/g cá. CHỦNG CH10 (LẦN 2) 0 20 40 60 80 100 120 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 Thời gian (giờ)
T ỷ l ệ b iể u h iệ n b ện h ( % ) 10^5 10^4 10^3 10^2 ĐC CHỦNG CH10 (LẦN 2) 0 20 40 60 80 100 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 Thời gian (giờ)
T ỷ l ệ c h ế t tí ch l ũ y ( % ) 10^5 10^4 10^3 10^2 ĐC LD50 = 5,62 x 103 cfu/g CHỦNG CoS01 (LẦN 2) 0 20 40 60 80 100 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 Thời gian (giờ)
T ỷ l ệ ch ết t íc h l ũ y ( % ) 10^5 10^4 10^3 10^2 ĐC LD50 = 2,51x 104 cfu/g CHỦNG CoS01 (LẦN 2) 0 20 40 60 80 100 120 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 Thời gian (giờ)
T ỷ l ệ b iể u h iệ n b ện h ( % ) 10^5 10^4 10^3 10^2 ĐC
Hình 3.12. Độc lực và tỷ lệ biểu hiện bệnh lở loét của hai chủng CH10 và CoS01 trên cá chẽm khỏe đợt 2
Tuy nhiên ở đợt 2, hai chủng chủng CoK03 và CoVL03 gây chết cá ở nồng độ tiêm 105 cfu/g, tỷ lệ chết tích lũy sau 10 ngày thí nghiệm lần lượt là 30% và 10%, song với tỷ lệ chết tích lũy thấp vẫn chưa tính được LD50 ở các nồng độ vi khuẩn thí nghiệm.
Bảng 3.2. LD50 (cfu/g) của 4 chủng V. alginolyticus qua 2 đợt thí nghiệm
CH10 CoS01 CoK03 và CoVL03
Chủng
Đợt 1 Đợt 2 Đợt 1 Đợt 2 Đợt 1 Đợt 2
LD50 6,31 x 103 5,62 x 103 3,16 x 104 2,51x 104 Trên 105
TB 5,96 x 103 2,84 x 104 Trên 105
Từ kết quả bảng 3.2.6 cho thấy chủng CH10 có độc lực cao với giá trị LD50 từ 5,62 x 103 đến 6,31 x 103 cfu/g, tiếp theo là chủng CoS01 với LD50 tương ứng từ 2,51x 104 đến 3,16 x 104 cfu/g, hai chủng còn lại LD50 ở trên 105 cfu/g cá.
Nhận xét: Như vậy, độc lực của 4 chủng V. alginolyticus đã kiểm tra trên cá chẽm khỏe là khác nhau. Hai chủng CH10 và CoS01 gây tỷ lệ chết tích lũy tăng dần theo nồng độ vi khuẩn đem tiêm với LD50 tương ứng là 5,96 x 103 và 2,84 x 104 cfu/g, tỷ lệ biểu hiện bệnh lở loét ở nồng độ 105 và 104 cfu/g đều là 100% trong quá trình thí nghiệm, ngoài biểu hiển lở loét chỗ vết tiêm còn có biểu hiện lở loét ngoài vùng tiêm. Đối với chủng CoK03, làm cá chẽm khỏe có biểu hiện bệnh lở loét, tuy nhiên mức độ loét nhẹ không làm cá chết trong quá trình thí nghiệm. Còn chủng CoVL03, cá có biểu hiện bệnh lở loét ở nồng độ cao 105 cfu/g tuy nhiên ở tỷ lệ thấp, mức độ biểu hiện nhẹ, các nồng độ thấp hơn không gây loét cho cá và cá không bị chết trong quá trình thí nghiệm. Hai chủng CoK03 và CoVL03 đều có giá trị LD50 ở trên 105 cfu/g. Kết quả phân lập trở lại từ những con cá có biểu hiện bệnh lở loét cho thấy vi khuẩn V. alginolyticus xuất hiện ở tất cả các cơ quan phân tích. Cá thí nghiệm ở lô đối chứng khỏe mạnh, ăn nhiều, không có biểu hiện bệnh lở loét và không bị chết trong quá trình thí nghiệm. Một nghiên cứu khác của Balebona (1998a) trên cá tráp đầu bạc (Sparus aurata L.) nuôi ở Tây Ban Nha cũng cho thấy V. alginolyticus là tác nhân chính gây bệnh với LD50 từ 5,4 x 104 đến 1 x 106 CFU/g cơ thể. Các dấu hiệu bệnh đặc trưng gây nên bởi tác nhân này như nhiễm trùng máu xuất huyết, cơ thể trở nên xám đen, một số trường hợp xuất hiện lở loét trên cơ thể, tích dịch ở màng bụng, gan xuất huyết [15]. Theo Liu (2004) khi nghiên cứu độc lực một chủng V.
alginolyticus là C3c01 trên cá giò Rachycentron canadum giống trọng lượng 8 – 10 g/con, đã cho kết quả LD50 là 3.28 x 104 cfu/g trọng lượng cơ thể cá với biểu hiện bệnh cá bơi lờ đờ, da sậm màu và chướng bụng giống với biểu hiện bệnh cá ngoài tự nhiên [51]. Trong một nghiên cứu trước đây, Lee (1995) báo cáo rằng một chủng V. alginolyticus là S3y có tính độc cho cá mú với giá trị LD50 là 0,5 × 103 cfu/g trọng lượng cơ thể cá. Sự khác biệt này có thể là do biến dạng khác nhau của các chủng hoặc đối tượng vật chủ nghiên cứu [49]. Theo Nguyễn Văn Hảo và Nguyễn Ngọc Du (2005) đã nhận định sự khác biệt về độc lực vi khuẩn phụ thuộc vào nguồn phân lập. Ngoài ra sự nhạy cảm với bệnh còn tùy thuộc vào độ tuổi của cá [1].
3.3 Thành phần Protein và LPS của 4 chủng V. alginolytics
3.3.1 Thành phần Protein của 4 chủng V. alginolytics
Dựa theo phương pháp của Laemmli (1970) [47] được bổ sung bởi Tsang và cs (1983) [73] . 5µg mẫu vi khuẩn CH10, CoS01, CoK03 và CoVL03 được ủ trong sample bufer 10% SDS ở 950C trước khi chạy điện di với hiệu điện thế 200V trong 40 phút. Bản gel được nhuộm bạc theo phương pháp của Wray và cs (1981) [80], sau 10 phút quan sát rõ các vạch protein thể hiện qua hình 3.12
Kết quả hình 3.12 cho thấy thành phần protein của 4 chủng V. alginolyticus là tương tự nhau với các vạch protein có khối lượng phân tử lần lượt là 106, 92, 75, 73, 68, 62, 55, 45, 38, 36, 32, 30, 27.5, 16.4 và 15.5 kDa, riêng chủng CH10 không thấy 2 vạch
Hình 3.13. Thành phần protein của 4 chủng V. alginolyticus
16.4 và 15.5 kDa, có thể do lượng vi khuẩn đưa vào ít nên 2 vạch này không quan sát thấy. Theo nghiên cứu của Chuan-fu và cs (2004) đưa ra kết luận protein màng ngoài (OMPs)
có khối lượng phân tử ở 36 kD là protein chính phổ biến trong V. parahaemolyticus và
V. alginolticus [21]. Theo kết quả của Wei-ni và cs (2007) khi phân tích protein của
V. alginolyticus thu từ cá bơn bị bệnh bằng SDS-PAGE cho thấy chủng nghiên cứu đã có 12 vạch protein, trong đó phần lớn protein nằm ở các vạch có khối lượng phân tử là 106, 73, 66, 51, 48, 45, 39, 36 và 32 kDa thể hiện ở 9 vạch đậm hơn trên bản gel và 3 loại protein còn lại có khối lượng phân tử là 92, 82 và 29 kDa. Đồng thời tác giả so sánh với thành phần OMPs của 8 chủng vi khuẩn khác thuộc nhóm Vibrio cũng cho thấy sự tương đồng về thành phần protein, trong đó các protein có khối lượng phân tử 65-105 kDa và 28-48 kD chiếm đa số, đặc biệt protein với khối lượng phân tử 36 kDa được thấy trong tất cả các chủng nghiên cứu [78].
Một nghiên cứu khác của Wei-ni và cs (2008) về cấu trúc của OMPs của 3 chủng vi
khuẩn V.alginolyticus SR1, V.ichthyoenteri HQ010223-1 và V.anguillarum S010610-1 gây bệnh
trên động vật thủy sản, so sánh với 11 chủng vi khuẩn thuộc giống Vibrio và 3 chủng vi khuẩn
thuộc giống khác (Edwardsiella tarda, Pseudomonas fluorescens và Escherichia coli). Kết quả
cho thấy cấu trúc của OMPs 3 chủng là tác nhân gây bệnh trên có 6-12 band protein. OMPs của
các chủng vi khuẩn Vibrio tương tự nhau, trong đó OMP 36 kDa được thấy ở tất cả 14 chủng vi khuẩn Vibrio nghiên cứu nhưng không có mặt ở trong các vi khuẩn thuộc giống khác. Kết quả
nghiên cứuđã khẳngđịnh OMP 36 kDa được sử dụngnhư một dấu hiệu nhận dạng cho các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio [79].
Một nghiên cứu gần đây của Ding và cs (2011) khi so sánh đặc điểm của protein màng ngoài vi khuẩn V. vulnificus và V.alginolyticus cho thấy V. alginolyticus có thành phần OMPs chủ yếu có khối lượng phân tử là 47 kDa, và 38 kDa, ngoài ra có mặt các vạch protein có khối lượng phân tử là 34, 30 và 29 kDa. Kết quả còn đưa ra nhận định protein tương ứng 38 kDa là loại protein có tính kháng nguyên mạnh ở 2 phẩy khuẩn V. vulnificus và V. alginolyticus [25].
Như vậy, thành phần protein vi khuẩn V.alginolyticus gây bệnh trên cá chẽm cũng có mặt các loại protein như các các nghiên cứu trên và hai loại protein chủ yếu là 36 và 38 kDa.
3.3.2. Kết quả phân tích LPS của 4 chủng V. alginolyticus
Dựa theo phương pháp của Tsai và Frasch (1982) [72], sau khi dùng nước cất dừng phản ứng. LPS của 4 chủng V. alginolyticus thể hiện ở hình 3.13:
Từ kết quả nhuộm LPS (hình 3.3.2) ta thấy biểu hiện LPS của 4 chủng nghiên cứu là không đồng nhất, điều này cũng giống với nghiên cứu của Akayli và cs (2008) [10] khi nghiên cứu về LPS của 4 chủng V.alginolyticus gây bệnh trên cá tráp (Sparus aurata) nuôi ở Thổ Nhĩ Kỳ.
Mặc dù chưa có nhiều nghiên cứu về LPS của V. alginolyticus để so sánh đây là phương pháp thích hợp xác định đặc tính kháng nguyên của loài vi khuẩn này.
Chương IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN
4.1. Kết luận
1. Đặc điểm sinh hóa của 4 chủng V. alginolyticus phân lập trên cá chẽm bệnh là tương tự nhau. Các chủng này có đặc điểm gram (-), hình que ngắn, di động, trên môi trường TCBS khuẩn lạc có màu vàng, bóng, lồi, bờ không đều. Trên môi trường TSA, khuẩn lạc có màu trắng sữa, dễ mọc loang. Có thể phát triển tốt nhiệt độ 37oC và ở các nồng độ muối 3%, 7%, 10%, nhưng không mọc trong môi trường muối 0%, nhạy với vibriostat 0/129, dương tính với Oxidase, Catalase, LDC, CIT, IND, GLU, MAN, SOR, SAC, AMY, NO2 nhưng âm tính với ADH, ODC,...
2. Độc lực của 4 chủng V. alginolyticus có sự khác nhau: LD50 của chủng CH10 là CH10 là thấp nhất từ 5,96 x 103 cfu/g sau đó kế tiếp là chủng CoS01 2,84 x 104 cfu/g. Riêng 2 chủng CoK03 và CoVL03 có LD50 ở trên 105 cfu/g. Cá sau khi tiêm vi khuẩn đều có biểu hiện lở loét tại vết tiêm và trên thân, dấu hiệu tương tự như bệnh ngoài tự nhiên. Thời gian xuất hiện bệnh từ 8-15h sau khi tiêm. Tỷ lệ nhiễm bệnh cao nhất ở chủng CH10 và giảm dần ở các chủng CoS01, CoK03 và CoVL03. Cá thí nghiệm ở lô đối chứng khỏe mạnh, ăn nhiều, không có biểu hiện bệnh lở loét và không bị chết trong quá trình thí nghiệm
3. Kết quả phân tích thành phần protein cho thấy 4 chủng V. alginolyticus là tương tự nhau với các band protein có khối lượng phân tử lần lượt là 106, 92, 75, 73, 68, 62, 55, 45, 38, 36, 32, 30, 27.5, 16.4 và 15.5 kDa. Ngoài ra kết quả phân tích LPS cho thấy biểu hiện LPS của 4 chủng nghiên cứu là không đồng nhất.
4.2 Đề xuất ý kiến
1. Cần nghiên cứu so sánh giữa 4 chủng V. alginolyticus nghiên cứu phân lập từ cá chẽm bệnh với chủng V. alginolyticus chuẩn để kết quả tin cậy hơn.
3. Cần có nghiên cứu tiếp theo về các protein của chủng vi khuẩn có tính độc lực cao để làm cơ sở sản xuất vaccine từ vi khuẩn V. alginolyticus phòng bệnh Vibriosis trên cá chẽm nuôi nói riêng và trên cá biển nói chung.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Nguyễn Văn Hảo và Nguyễn Ngọc Du (2005). Tổng quan về các bệnh nguy hiểm thường gặp trên động vật nuôi biển, Báo cáo đề tài khoa học. Viện Nghiên Cứu NTTS II, TP. Hồ Chí Minh.
2. Đỗ Thị Hoà (2003), “ Phương pháp chẩn đoán bệnh do vi khuẩn ở động vật thuỷ sản”.
Bài giảng thực hành bệnh vi khuẩn. Trường ĐH Nha Trang, Khánh Hoà.
3. Đỗ Thị Hoà, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng và Nguyễn Thị Muội (2004). Bệnh
học thuỷ sản. NXB Nông Nghiệp, TP. Hồ Chí Minh.
4. Đỗ Thị Hòa, Trần Vĩ Hích, Nguyễn Thị Thùy Giang, Phan Văn Út, Nguyễn Thị Nguyệt Huệ, 2008. Các loại bệnh thường gặp trên các biển nuôi ở Khánh Hòa. Tạp chí Khoa học Công nghệ Thủy sản, số 02, Trường Đại học Nha Trang, trang 16 - 24.
5. Nguyễn Ngọc Nhiên (1992). Sổ tay thí nghiệm bệnh cá vi sinh (dịch từ bảng gốc của J.A. Plumb & P.R. Bower). Bộ thủy sản, Hà Nội.
6. Bùi Quang Tề (1995). Thực hành chuẩn đoán bệnh tôm cá. Viện Nghiên Cứu NTTS I, Bộ Thủy Sản, Hà Nội
7. Nguyễn Thị Thanh Thuỳ (2005). Tìm hiểu bệnh lở loét ở cá mú (Serrranidea) nuôi tại
Khánh Hoà. Luận văn Thạc sĩ, Viện Nghiên Cứu NTTS III, Khánh Hoà.
8. Viên Đại Phúc (2011). Tìm hiểu tác nhân gây bệnh lở loét trên cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi lồng biển tại Nha Trang – Khánh Hòa. Luận văn Thạc sĩ, Viện Nghiên Cứu NTTS III, Khánh Hoà.
Tài liệu tiếng Anh
9. Aguirre-Guzmán G, H. Mejia Ru›z, F. Ascencio (2004). A review of extracellular virulence product of Vibrio species important in diseases of cultivated shrimp. Aquac Res 35:1395–1404.
10.Akayli T., G. Timur, B. Aydemir, A.R. Kiziler, O. Coskun, G. Albayrak và E. Arican (2008). Characterization of Vibrio alginolyticus Isolates from Diseased
Cultured Gilthead Sea Bream, Sparus aurata. The Israeli Journal of Aquaculture – Bamidgeh 60(2), 2008, 89-94.
11.Amel Ben Kahla-Nakbi, K. Chaieb, A. Bakhrouf (2009). Investigation of several virulence properties among Vibrio alginolyticus strains isolated from diseased cultured fish in Tunisia. Diseases of aquatic organisms. Vol. 86: 21–28.
12.Austin B., L.F. Stuckey, A.W. Robertson, I. Effendi và D.R.W. Griffith (1995b).
A probiotic strain of Vibrio alginolyticus effective in reducing diseases caused by Aeromonas salmonicida, Vibrio anguillarum and Vibrio ordalii. J. Fish Dis., 18(1):93-96.
13.Austin B. và D. A. Austin (2007). Bacterial Fish Pathogens. Diseases of Farmed and Wild Fish. Fourth Edition. Springer.
14.Avendan ˜o-Herrera R., J. Rodrı ´guez, B. Magarin ˜os, J.L. Romalde, A.E. Toranzo (2004b). Intraspecific diversity of the marine fish pathogen Tenacibaculum maritimum as determined by randomly amplified polymorphic DNA-PCR. J. Appl. Microbiol. 96, 871–877.
15.Balebona M.C., M.J. Andreu, M.A. Bordas, I. Zorrilla, M.A. Morinigo và J.J. Borrego (1998a). Pathogenicity of Vibrio alginolyticus for cultured gilt-head sea bream (Sparus aurata L.). Appl. Environ. Microbiol., 64(11): 4269-4275.
16.Balebona M. C., I. Zorrilla, M. A. Moriñigo, J. J. Borrego (1998b). Survey of bacterial pathologies affecting farmed gilt-head sea bream (Sparus aurata L.) in southwestern Spain from 1990 to 1996. Aquaculture 166:19–35.
17.Bercovier H., C. Ghittino, A. Eldar (1997). Immunization with bacterial antigens: infections with streptococci and related organisms. In: Gudding, R., Lillehaug, A., Midtlyng, P.J., Brown, F. (Eds.), Fish Vaccinology. Karger, Basel, Switzeland, pp. 153– 160.
18.Bromage E. S., A. Thomas, L. Owens (1999), Streptococcus iniae, a bacterial infection in Barramundi Lates calcarifer.Dis Aqua Org, Vol. 36: 177-181.
19.Cai J. , H. Han, Z. Song, C. Li, J. Zhou (2006). Isolation and characterization of pathogenic Vibrio alginolyticus from diseased postlarval abalone, Haliotis diversicolor supertexta (Lischke). Aquac Res 37:1222–1226.
20.Chen M.F., D. Henry-Ford, J.M. Groff (1995). Isolation of Flexibacter maritimus from California, FHS/AFS Newsl. 22, 7–11.
21.Chuan-fu D., L. Tian-long, X. Bin-fu, G. Hui, L. Neng-feng, (07-2004).
Electrophoretic and immunobot analysis of the major outer membrane protein (MOMP) and polysaccharides antigen(PSA) of Vibrioparaheamolyticus and Vibrio alginolticus. Chinese Journal of Zoonoses. (Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350003,China).