CHƯƠNG III : PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4 Phương pháp
3.4.2 Cách phân lập
Phân lập vi khuẩn
- Cho 2 g đất cho vào bình tam giác có 40 ml nước cất đã khử trùng.
Lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 2 giờ.
- Hút 100 µl dung dịch mẫu cho vào đĩa petri đã chuẩn bị sẵn môi
trường, trải đều. Sau đó đem ủ ở 320C trong 48 – 72 giờ.
- Chọn những khuẩn lạc rời, đều, có các hình dạng khác nhau, cấy
chuyển qua những đĩa môi trường mới. Thực hiện chuyển vi khuẩn nhiều lần
đến khi thấy khuẩn lạc nằm trên đường cấy, rời, đều, cùng màu thì kiểm tra độ
thuần và xem đó là một dịng.
- Sau đó trữ trong mơi trường glycerol lỏng ở - 200C. Quan xác hình thái khuẩn lạc và khả năng di động
- Quan xác hình thái khuẩn lạc dưới kính lúp, mơ tả hình dạng, khích thước, màu sắc, bìa và độ nổi.
- Kiểm tra khả năng di động: môi trường Aleksandrov bán lỏng (0,7%
agarose) (Aleksandrov et al., 1967), dùng kim cấy đầu nhọn cấy vi khuẩn sâu vào môi trường. Kiểm tra khả năng di động sau 24 giờ trong 3 ngày. Dòng vi khuẩn nào có khả năng di chuyển lên mặt mơi trường hay mọc lan trong mơi trường thì có khả năng di động
Nhuộm Gram
- Nguyên tắc: do sự khác biệt cấu trúc vách tế bào nên vi khuẩn Gram [+] sẽ giữ được phức hợp tím Gentian-iode khơng bị tẩy bởi alcol. Trong khi
đó, vi khuẩn Gram [-] không giữ được phức hợp này.
- Các bước tiến hành:
Làm một phết vi khuẩn trên lame
Cho vài giọt Crystal violet lên phết vi khuẩn, để yên 10 giây. Sau đó
rửa nhanh bằng nước.
Cho tiếp vài giọt Lugol lên phết vi khuẩn, để yên 10 giây. Sau đó rửa
Trang 33
Tẩy màu bằng alcol cho đến khi giọt alcol rời khỏi lame sạch màu. Sau
đó rửa nhanh bằng nước.