Hóa chất Nồng độ (g/l)
Peptone 5
Meat extract 3
NaCl 5
pH 7,4 Hóa chất kiểm tra khả năng hịa tan lân
Dung dịch A:
(1) 12 g (NH4)6MoO24.4H2O (Amoniummolydate) + 250 ml H2O (2) 0,2908 g KsbOC4H2O6 (Potassium antymony tartrate) + 100 ml H2O (3) 140 ml H2SO4 đậm đặc và thêm H2O vào từ từ cho đủ 1 lít.
(4) cho (1) và (2) vào (3) sau đó thêm H2O vào cho đủ 2 lít. Dung dịch B: 1,05 g acid ascorbic + 200 ml dung dịch A.
3.4 Phương pháp 3.4.1 Thu mẫu đất 3.4.1 Thu mẫu đất
- Lấy 15 mẫu đất ở nhiều vị trí khác nhau trong những hốc đá(lưu ý
chọn những cây phát triển tốt) trên núi Két – An Giang (hình 3.1)
- Cho vào bao nylon đem về phịng thí nghiệm để khơ ở nhiệt độ
phịng.
Trang 32
3.4.2 Cách phân lập
Phân lập vi khuẩn
- Cho 2 g đất cho vào bình tam giác có 40 ml nước cất đã khử trùng.
Lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 2 giờ.
- Hút 100 µl dung dịch mẫu cho vào đĩa petri đã chuẩn bị sẵn mơi
trường, trải đều. Sau đó đem ủ ở 320C trong 48 – 72 giờ.
- Chọn những khuẩn lạc rời, đều, có các hình dạng khác nhau, cấy
chuyển qua những đĩa môi trường mới. Thực hiện chuyển vi khuẩn nhiều lần
đến khi thấy khuẩn lạc nằm trên đường cấy, rời, đều, cùng màu thì kiểm tra độ
thuần và xem đó là một dịng.
- Sau đó trữ trong mơi trường glycerol lỏng ở - 200C. Quan xác hình thái khuẩn lạc và khả năng di động
- Quan xác hình thái khuẩn lạc dưới kính lúp, mơ tả hình dạng, khích thước, màu sắc, bìa và độ nổi.
- Kiểm tra khả năng di động: môi trường Aleksandrov bán lỏng (0,7%
agarose) (Aleksandrov et al., 1967), dùng kim cấy đầu nhọn cấy vi khuẩn sâu vào môi trường. Kiểm tra khả năng di động sau 24 giờ trong 3 ngày. Dịng vi khuẩn nào có khả năng di chuyển lên mặt môi trường hay mọc lan trong mơi trường thì có khả năng di động
Nhuộm Gram
- Nguyên tắc: do sự khác biệt cấu trúc vách tế bào nên vi khuẩn Gram [+] sẽ giữ được phức hợp tím Gentian-iode khơng bị tẩy bởi alcol. Trong khi
đó, vi khuẩn Gram [-] khơng giữ được phức hợp này.
- Các bước tiến hành:
Làm một phết vi khuẩn trên lame
Cho vài giọt Crystal violet lên phết vi khuẩn, để yên 10 giây. Sau đó
rửa nhanh bằng nước.
Cho tiếp vài giọt Lugol lên phết vi khuẩn, để yên 10 giây. Sau đó rửa
Trang 33
Tẩy màu bằng alcol cho đến khi giọt alcol rời khỏi lame sạch màu. Sau
đó rửa nhanh bằng nước.
Cho tiếp vài giọt Safranin lên phết vi khuẩn, để yên 10 giây. Sau đó rửa nhanh bằng nước. Để khơ tự nhiên.
Quan sát dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần. Vi
khuẩn Gram dương (+) bắt màu tím, Gram âm (-) bắt màu đỏ.
3.4.3 Kiểm tra khả năng hòa tan lân – kali khó tan của các dịng vi khuẩn khuẩn
Xác định khả năng hịa tan lân khó tan của các dịng vi khuẩn
- Dùng thuốc thử acid Ascorbic Amoniummolypdate Potassium antinomol tartrate để đánh giá lượng lân được vi khuẩn hòa tan trong dung
dịch theo nguyên lí:
Chất lân hịa tan trong mơi trường sẽ tác dụng với Amoniummolypdate trong môi trường acid tạo thành hợp chất phosphomolypdate màu vàng.
Dưới sự hiện diện của chất khử, Mo6+ bị khử thành Mo3+ hoặc Mo2+ làm cho dung dịch có màu xanh (hình 3.2).
H2PO4- + NH4+ + MoO42+ + 2 H+ → (NH4)3[P(MoO10) 4] Cường độ màu xanh thay đổi theo hàm lượng lân có trong dịch, pH và
điều kiện khử của môi trường. Đo mẫu trên máy so màu ở bước sóng 880 nm.
Trong môi trường acid vừa phải, nồng độ molypdate dư thừa, lượng
chất khử cố định, nồng độ lân nhỏ ở phạm vi nhất định thì mật độ quang học của màu xanh tỉ lệ thuận với hàm lượng lân.
Trang 34
Hình 3.2: Phản ứng màu sau khi cho thuốc thử vào dịch nuôi vi khuẩn - Tiến hành
Nuôi vi khuẩn trong môi trường SW – LB thu sinh khối
Hút 1 ml cho vào môi trường Aleksandrov lỏng (Aleksandrov et al., 1967) nuôi trên máy lắc với tốc độ 120 vịng/phút.
Lấy mẫu ni ở thời điểm 5, 10 và 15 ngày. Sau đó ly tâm 12.000
vòng/phút trong 5 phút. Hút 0,5 ml dung dịch mẫu cho vào ống nghiệm chứa 5 ml nước khử khoáng. Thêm 4 ml dung dịch B và 3 ml nước vào mỗi ống, trộn
đều dung dịch bằng máy khuấy. Để ổn định 15 – 20 phút tại nhiệt độ phòng và
tiến hành đo lượng lân hòa tan (P2O5) bằng phương pháp so màu Oniani ở
bước sóng 880 nm (OD880 nm).
Xây dựng đường chuẩn P2O5: gồm 6 ống nghiệm (loại 20 ml), đánh số thứ tự từ 0 đến 5, lần lượt thêm vào mỗi ống nghiệm các thành phần ở bảng
Trang 35 Bảng 3.4: Thành phần đường chuẩn P2O5 Hóa chất Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Nước khử khoáng (ml) 5 5 5 5 5 5
Dung dịch lân chuẩn
(ml) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Dung dịch B (ml) 4 4 4 4 4 4 Nước khử khoáng (ml) 3,5 3 2,5 2 1,5 1 Hàm lượng P2O5/1 ống (mg/l) 0 10 20 30 40 50
Trộn đều dung dịch trong các ống nghiệm trên máy vortex và để ở nhiệt
độ phòng khoảng 15 - 20 phút để phản ứng tạo màu xảy ra theo nguyên tắc
hàm lượng P2O5 càng cao thì màu xanh càng đậm dần (Hình 3.3). Ống số 0 là
ống có đối chứng âm. Khi đó, đường chuẩn với nồng độ với nồng độ các ống
theo thứ tự 0,0 - 0,5 - 1,0 - 1,5 - 2,0 - 2,5 mgP2O5/l.
Trang 36
Đo giá trị OD ở 6 ống nghiệm để xây dựng đường chuẩn, sau đó mới
tiến hành đo OD của các nghiệm thức.
Sử dụng giá trị OD của ống số 0 (khơng có P2O5, khơng có màu xanh) làm mẫu blank đưa giá trị OD về 0, tiến hành đo giá trị OD của 5 ống còn lại. 5 ống nghiệm 1, 2, 3, 4, 5 có màu xanh đậm dần sẽ tương ứng với 5 giá trị OD tăng dần.
Sử dụng phần mềm Excel vẽ đồ thị xác định phương trình đường
chuẩn của P2O5
Phương trình đường chuẩn: Y = a*X + b Trong đó: X là nồng độ của mẫu (mg/l)
Y là độ hấp thụ quang (OD)
Xác định khả năng hịa tan kali khó tan của các dịng vi khuẩn - Tiến hành
Nuôi vi khuẩn trong môi trường SW – LB thu sinh khối
Hút 1 ml cho vào môi trường Aleksandrov lỏng (Aleksandrov et al., 1967) nuôi trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút.
- Lấy 5 ml mẫu nuôi ở ngày nuôi thứ 10 lọc qua giấy lọc Whatman lấy dịch trong pha loãng 20 lần đo lượng kali hòa tan bằng phương
pháp thử AAS ở bước sóng 766,5 nm được thực hiện bởi Phịng thí nghiệm Chuyên sâu – Trường Đại học Cần.
Trang 37
CHƯƠNG IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn
Từ 15 mẫu đất thu tại núi Két - An Giang, chúng tơi đã phân lập được 48 dịng vi khuẩn có khả năng phát triển trên mơi trường Aleksandorv.
4.1.1 Đặc điểm khuẩn lạc các dòng vi khuẩn
Sau khi phân lập ròng, tiến hành cấy các dòng vi khuẩn này trên đĩa
petri có chứa mơi trường Aleksandrov đặc để quan sát và mô tả đặc điểm
khuẩn lạc. Thời gian trung bình để các dòng vi khuẩn phát triển thành khuẩn
lạc trên môi trường phân lập là khá chậm (48 – 72 giờ) ở 320C.
* Đặc điểm của khuẩn lạc
Các dòng vi khuẩn phân lập hầu hết khuẩn lạc có dạng trịn, bìa ngun, mơ, kích thước từ 0,5 – 6 mm.
- Hình dạng của khuẩn lạc: 35/48 dòng vi khuẩn có dạng trịn, chiếm 72,9%; 13/48 dịng có dạng khuẩn lạc khơng đều, chiếm 27,1%.
- Màu sắc của khuẩn lạc: trong tổng số các dòng vi khuẩn phân lập
được thì 23/48 dịng có màu trắng đục, chiếm 47,9%; 12/48 dịng có màu trắng
trong, chiếm 25%; 7/48 dịng có màu nâu đậm, chiếm 14,6%; 7/48 dịng có màu nâu nhạt, chiếm 12,5%.
- Dạng bìa của khuẩn lạc: 40/48 dịng phân lập có dạng bìa ngun, chiếm 83,3%; 8/48 dịng phân lập có dạng rìa răng cưa, chiếm 16,7%.
- Độ nổi của khuẩn lạc: 41/48 dịng có độ nổi mơ, chiếm 85,4%; 7/48 dịng có độ nổi phẳng chiếm 14,6%.
Trang 38
Bảng 4.1: Đặc điểm khuẩn lạc sau 3 ngày ni của các dịng vi khuẩn STT Dịng STT Dịng
vi khuẩn
Đặc điểm khuẩn lạc
Hình dạng Bìa Màu Độ nổi Kích thước
(mm) 1 KP1B Tròn Nguyên Trắng đục Mô 2 - 3 2 KP2B Không đều Nguyên Trắng đục Mô 3 3 KP3B Không đều Nguyên Nâu đậm Mô 2 4 KP4B Không đều Nguyên Trắng đục Mô 1 5 KP5B Không đều Nguyên Nâu nhạt Mô 2 6 KP6B Không đều Răng cưa Trắng đục Mô 2 - 3 7 KP7B Trịn Răng cưa Trắng đục Mơ 0,5 - 1 8 KP8B Tròn Răng cưa Trắng đục Mô 1 – 1,5 9 KP9B Không đều Nguyên Trắng đục Mô 5 10 KP10B Không đều Nguyên Nâu nhạt Phẳng 2 11 KP11B Tròn Nguyên Trắng trong Mơ 1 12 KP12B Trịn Nguyên Nâu đậm Phẳng 1 13 KP13B Tròn Nguyên Trắng đục Phẳng 1,5 - 2 14 KP14B Tròn Nguyên Nâu đậm Mô 1 - 2 15 KP15B Tròn Nguyên Nâu đậm Mơ 2 16 KP16B Trịn Nguyên Nâu nhạt Mô 6 17 KP17B Trịn Ngun Trắng trong Mơ 1 18 KP18B Tròn Nguyên Trắng trong Mô 2 - 3 19 KP19B Trịn Ngun Trắng trong Mơ 1 20 KP20B Tròn Nguyên Trắng trong Mô 2 21 KP21B Trịn Ngun Trắng đục Mơ 2 22 KP22B Tròn Răng cưa Trắng đục Mô 1 – 1,5 23 KP23B Không đều Nguyên Trắng trong Mô 2 24 KP24B Tròn Nguyên Trắng trong Mô 1 25 KP25B Trịn Ngun Trắng đục Mơ 0,5 - 1 26 KP26B Tròn Nguyên Trắng trong Mô 0,5 - 1 27 KP27B Tròn Răng cưa Trắng trong Mơ 1 28 KP28B Trịn Ngun Trắng đục Mô 2 29 KP29B Không đều Răng cưa Trắng đục Mơ 2 - 3 30 KP30B Trịn Nguyên Trắng đục Mô 0,5 - 1 31 KP31B Tròn Nguyên Trắng đục Mô 2 - 3
Trang 39
32 KP32B Không đều Nguyên Nâu đậm Phẳng 2 - 3 33 KP33B Không đều Nguyên Trắng đục Phẳng 2 34 KP34B Không đều Răng cưa Trắng đục Mô 1 35 KP35B Không đều Răng cưa Trắng đục Mơ 1 - 2 36 KP36B Trịn Nguyên Trắng trong Mô 1 37 KP37B Tròn Nguyên Trắng đục Mơ 1 38 KP38B Trịn Ngun Trắng trong Mô 2 39 KP39B Tròn Nguyên Trắng đục Phẳng 3 40 KP40B Tròn Nguyên Trắng đục Mơ 2 41 KP41B Trịn Nguyên Trắng trong Mô 2 42 KP42B Tròn Nguyên Nâu nhạt Mơ 1,5 43 KP43B Trịn Ngun Nâu nhạt Mô 3 – 4 44 KP44B Tròn Nguyên Nâu đậm Mơ 1 – 2 45 KP45B Trịn Nguyên Trắng đục Mô 1,5 - 2 46 KP46B Tròn Nguyên Nâu đậm Mơ 0,5 47 KP47B Trịn Nguyên Trắng đục Mô 1 – 2 48 KP48B Tròn Nguyên Nâu nhạt Phẳng 1,5 - 2
Trang 40
Hình 4.1: Hình dạng khuẩn lạc của dịng KP1B, KP2B, KP3B, KP7B, KP13B và KP16B sau 3 ngày nuôi trên môi trường Aleksandorv.
Trang 41
Hình 4.2: Hình dạng khuẩn lạc của dòng KP17B, KP18B, KP24B, KP27B, KP32B và KP33B sau 3 ngày ni trên mơi trường Aleksandorv.
Trang 42
Hình 4.3: Hình dạng khuẩn lạc của dịng KP35B, KP41B, KP45B và KP47B sau 3 ngày nuôi trên môi trường Aleksandorv.
4.1.2 Hình dạng tế bào, khả năng chuyển động và kết quả nhuộm Gram của các dòng vi khuẩn Gram của các dòng vi khuẩn
Quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000 lần cho thấy 26/48 dịng vi khuẩn có dạng hình cầu khơng đều, chiếm 54,2%. 14/48 dịng vi khuẩn có dạng hình bầu dục, chiếm 29,1%. 6/48 dòng vi khuẩn có hình que dài chiếm 12,5%. 2/48 vi khuẩn có dạng hình que ngắn, chiếm 4,2%.
Kết quả nhuộm Gram cho thấy 48 dòng vi khuẩn phân lập đều có Gram âm, chiếm 100% (bảng 4.2).
Trang 43
Bảng 4.2: Đặc điểm tế bào sau 3 ngày ni của các dịng vi khuẩn STT STT Dòng vi khuẩn Đặc điểm tế bào Hình dạng Gram Di động 1 KP1B Bầu dục - +++
2 KP2B Cầu không đều - +++ 3 KP3B Cầu không đều - ++ 4 KP4B Cầu không đều - +++ 5 KP5B Cầu không đều - +++
6 KP6B Bầu dục - +
7 KP7B Bầu dục - +
8 KP8B Cầu không đều - +
9 KP9B Cầu không đều - ++ 10 KP10B Cầu không đều - +++ 11 KP11B Cầu không đều - ++ 12 KP12B Cầu không đều - + 13 KP13B Cầu không đều - ++ 14 KP14B Cầu không đều - +++ 15 KP15B Cầu không đều - +++ 16 KP16B Cầu không đều - +++
17 KP17B Que ngắn - +
18 KP18B Que ngắn - +
19 KP19B Cầu không đều - +
20 KP20B Que ngắn - +
21 KP21B Cầu không đều - +++
22 KP22B Bầu dục - + 23 KP23B Que ngắn - + 24 KP24B Que ngắn - + 25 KP25B Que ngắn - + 26 KP26B Que dài - + 27 KP27B Bầu dục - + 28 KP28B Bầu dục - + 29 KP29B Bầu dục - +
30 KP30B Cầu không đều - +++ 31 KP31B Cầu không đều - + 32 KP32B Cầu không đều - +++
Trang 44
33 KP33B Cầu không đều - +++
34 KP34B Bầu dục - +
35 KP35B Bầu dục - +
36 KP36B Cầu không đều - +++
37 KP37B Bầu dục - +
38 KP38B Que - +
39 KP39B Cầu không đều - ++ 40 KP40B Cầu không đều - ++ 41 KP41B Cầu không đều - +++
42 KP42B Bầu dục - +++
43 KP43B Cầu không đều - +++
44 KP44B Bầu dục - +
45 KP45B Bầu dục - +++
46 KP46B Cầu không đều - +++
47 KP47B Bầu dục - ++
48 KP48B Cầu không đều - +++
Hình 4.4:Kết quả nhuộm gram và hình dang tế bào dịng KP26B và hình dang tế bào dịng KP26B
Hình 4.5: Kết quả nhuộm gram và hình dang tế bào dịng KP1B và hình dang tế bào dịng KP1B
Hình 4.6: Kết quả nhuộm gram và hình dang tế bào dịng KP27B và hình dang tế bào dịng KP27B
Hình 4.7: Kết quả nhuộm gram và hình dang tế bào dịng KP44B và hình dang tế bào dòng KP44B
Trang 45
4.2 Kết quả hòa tan lân của các dòng vi khuẩn
Tất cả các dòng vi khuẩn phân lập đều được nuôi trên môi trường
Aleksandrov lỏng để xác định lượng lân hòa tan (mgP2O5/l) ở mỗi dòng.
4.2.1 Kết quả hòa tan lân ở 5 ngày
Dựa vào kết quả thu được (bảng 1 phần phụ lục) và kết quả thống kê
(bảng 5 phần phụ lục), cho thấy lượng P2O5 hịa tan giữa các dịng vi khuẩn có khác biệt.
So sánh với mẫu đối chứng (5,55 mgP2O5/l) hàm lượng lân hòa tan trong 5 ngày ni của 35/48 (72,9%) dịng vi khuẩn khác biệt có ý nghĩa thống kê.
Có 9/35 (25,7%) dịng vi khuẩn có khả năng hòa tan cao hơn 80 mgP2O5/l. Trong đó có 2 dịng KP30B: 139,07 mgP2O5/l và KP41B: 114,47 mgP2O5/l có khả năng hịa tan lân khó tan cao hơn 100 mgP2O5/l và có sự khác biệt với các dịng cịn lại.
Có 26/35 (74,3%) dịng có khả năng hòa tan từ 36 mgP2O5/l đến 80
mgP2O5/l, có sự khác biệt với nhau và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng.
Trang 46
Hàm lượng lân hòa tan tăng lên sau 5 ngày ủ trong dịch nuôi vi khuẩn tăng rất cao và có sự khác biệt hoàn toàn so với đối chứng dòng KP30B:
139,07 mgP2O5/l; KP41B: 114,47 mgP2O5/l.
So sánh kết quả trên với các nghiên cứu trước của Xiufang et al. (2006) hai dòng KNP413, KNP414 được phân lập từ đất núi Tianmu, tỉnh Chiết
Giang (Trung Quốc) và Bacillus mucilaginosus AS1.153 đang được ứng dụng làm phân vi sinh ở Trung Quốc, hai dịng này có khả năng hịa tan lân sau 5 ngày nuôi (KNP413: 62 mgP2O5/l; KNP414: 114 mgP2O5/l). Đoàn Chiến
Thắng (2010) phân lập 10 dòng vi khuẩn trên đất bazan đỏ ở Đak Lak thì dịng M7 (18,09 mgP2O5/l) có khả năng hòa tan lân đạt tốt nhất vào 5 ngày sau khi
ủ. Thân Ngọc Hiếu (2010) phân lập được 22 dịng vi khuẩn có khả năng hịa
tan lân từ núi đá vôi thuộc Hà Tiên – Kiên Giang thì có 11 dịng có khả năng hịa tan lân sau 5 ngày nuôi (CH10C: 12,08 mgP2O5/l). Phan Thị Nhã (2009) 7 dòng vi khuẩn nội sinh phân lập từ rể, thân, lá cây khóm ở thành phố Vị