CHƯƠNG III : PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4 Phương pháp
3.4.3 Kiểm tra khả năng hòa tan lân – kali khó tan của các dòng
nhanh bằng nước. Để khô tự nhiên.
Quan sát dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần. Vi
khuẩn Gram dương (+) bắt màu tím, Gram âm (-) bắt màu đỏ.
3.4.3 Kiểm tra khả năng hòa tan lân – kali khó tan của các dòng vi khuẩn khuẩn
Xác định khả năng hịa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn
- Dùng thuốc thử acid Ascorbic Amoniummolypdate Potassium antinomol tartrate để đánh giá lượng lân được vi khuẩn hòa tan trong dung
dịch theo nguyên lí:
Chất lân hịa tan trong mơi trường sẽ tác dụng với Amoniummolypdate trong môi trường acid tạo thành hợp chất phosphomolypdate màu vàng.
Dưới sự hiện diện của chất khử, Mo6+ bị khử thành Mo3+ hoặc Mo2+ làm cho dung dịch có màu xanh (hình 3.2).
H2PO4- + NH4+ + MoO42+ + 2 H+ → (NH4)3[P(MoO10) 4] Cường độ màu xanh thay đổi theo hàm lượng lân có trong dịch, pH và
điều kiện khử của môi trường. Đo mẫu trên máy so màu ở bước sóng 880 nm.
Trong mơi trường acid vừa phải, nồng độ molypdate dư thừa, lượng
chất khử cố định, nồng độ lân nhỏ ở phạm vi nhất định thì mật độ quang học của màu xanh tỉ lệ thuận với hàm lượng lân.
Trang 34
Hình 3.2: Phản ứng màu sau khi cho thuốc thử vào dịch nuôi vi khuẩn - Tiến hành
Nuôi vi khuẩn trong môi trường SW – LB thu sinh khối
Hút 1 ml cho vào môi trường Aleksandrov lỏng (Aleksandrov et al., 1967) nuôi trên máy lắc với tốc độ 120 vịng/phút.
Lấy mẫu ni ở thời điểm 5, 10 và 15 ngày. Sau đó ly tâm 12.000
vòng/phút trong 5 phút. Hút 0,5 ml dung dịch mẫu cho vào ống nghiệm chứa 5 ml nước khử khoáng. Thêm 4 ml dung dịch B và 3 ml nước vào mỗi ống, trộn
đều dung dịch bằng máy khuấy. Để ổn định 15 – 20 phút tại nhiệt độ phòng và
tiến hành đo lượng lân hòa tan (P2O5) bằng phương pháp so màu Oniani ở
bước sóng 880 nm (OD880 nm).
Xây dựng đường chuẩn P2O5: gồm 6 ống nghiệm (loại 20 ml), đánh số thứ tự từ 0 đến 5, lần lượt thêm vào mỗi ống nghiệm các thành phần ở bảng
Trang 35 Bảng 3.4: Thành phần đường chuẩn P2O5 Hóa chất Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Nước khử khoáng (ml) 5 5 5 5 5 5
Dung dịch lân chuẩn
(ml) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Dung dịch B (ml) 4 4 4 4 4 4 Nước khử khoáng (ml) 3,5 3 2,5 2 1,5 1 Hàm lượng P2O5/1 ống (mg/l) 0 10 20 30 40 50
Trộn đều dung dịch trong các ống nghiệm trên máy vortex và để ở nhiệt
độ phòng khoảng 15 - 20 phút để phản ứng tạo màu xảy ra theo nguyên tắc
hàm lượng P2O5 càng cao thì màu xanh càng đậm dần (Hình 3.3). Ống số 0 là
ống có đối chứng âm. Khi đó, đường chuẩn với nồng độ với nồng độ các ống
theo thứ tự 0,0 - 0,5 - 1,0 - 1,5 - 2,0 - 2,5 mgP2O5/l.
Trang 36
Đo giá trị OD ở 6 ống nghiệm để xây dựng đường chuẩn, sau đó mới
tiến hành đo OD của các nghiệm thức.
Sử dụng giá trị OD của ống số 0 (khơng có P2O5, khơng có màu xanh) làm mẫu blank đưa giá trị OD về 0, tiến hành đo giá trị OD của 5 ống còn lại. 5 ống nghiệm 1, 2, 3, 4, 5 có màu xanh đậm dần sẽ tương ứng với 5 giá trị OD tăng dần.
Sử dụng phần mềm Excel vẽ đồ thị xác định phương trình đường
chuẩn của P2O5
Phương trình đường chuẩn: Y = a*X + b Trong đó: X là nồng độ của mẫu (mg/l)
Y là độ hấp thụ quang (OD)
Xác định khả năng hịa tan kali khó tan của các dòng vi khuẩn - Tiến hành
Nuôi vi khuẩn trong môi trường SW – LB thu sinh khối
Hút 1 ml cho vào môi trường Aleksandrov lỏng (Aleksandrov et al., 1967) nuôi trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút.
- Lấy 5 ml mẫu nuôi ở ngày nuôi thứ 10 lọc qua giấy lọc Whatman lấy dịch trong pha loãng 20 lần đo lượng kali hòa tan bằng phương
pháp thử AAS ở bước sóng 766,5 nm được thực hiện bởi Phịng thí nghiệm Chuyên sâu – Trường Đại học Cần.
Trang 37