2. Tên đề tài: Xây dựng quy trình xác định dƣ lƣợng Trifluralin trong thủy sản
2.5. Độc tính của Trifluralin
Độc cấp tính: Hàm lượng gây độc cấp tính (LD50) của Trifluralin đối với động vật trên cạn cao hơn (ít độc hơn) so với động vật thủy sinh, giá trị LD50 khoảng 10g/kg đối với chuột (rat), hơn 0,5g/kg đối với chuột nhắt (mice) và hơn 2g/kg đối với thỏ, chó và gà. Lượng Trifluralin bài tiết qua phân chiếm 80% và qua nước tiểu là 20%.
Tuy nhiên, LD50 thông qua đường miệng cho các sản phẩm thương mại sẽ thấp hơn. Ví dụ như Treflan TR-10 trên chuột nhiều hơn 500 mg/kg. Sự nhạy cảm của da (dị ứng) cớ thể xảy ra đối với một số cá nhân tiếp xúc với Trifluralin. Hít có thể là ngun nhân gây kích thích niêm mạc của miệng, cổ họng hoặc là phổi. Triệu chứng của tình trạng hít phải hơi vào sẽ gây nhức đầu, hoa mắt và có thể ngã quỵ xuống; nếu như ăn vào bụng thì sẽ gây ra buồn nơn, chuột rút và nó có thể kích thích lên mắt.
Độc mãn tính: Độc mãn tính gây nên sự xuất hiện các khối u ác tính trong thận, bàng quang và tuyến giáp của chuột. Trên chột nhắt cũng thấy khối u trong gan, phổi, dạ dày. Trifluralin không tinh khiết (impurity) có thể chứa N-nitrosamine, đây là chất có thể gây các khối u và có thể gây đột biến gen trên động vật. Cơ chế hình thành các khối u thì chưa được xác định, nhưng trong trường hợp các khối u xuất hiện trong tuyến giáp và tinh hoàn được cho là có liên quan đến hệ nội tiết. Trifluralin làm giảm hàm lượng testosterone, FSH, LH đồng thời làm giảm số lượng tế bào mầm (germinal cell) và tế bào sinh dưỡng (somatic cell) trong tinh hoàn của chuột. Trifluralin cũng làm giảm hàm lượng LH, nhưng làm tăng hàm lượng cortisol, estradiol và insulin ở cừu. Chưa có bằng chứng rõ ràng về tác động gây độc của Trifluralin lên hệ gen, đột biến gen trên động vật. Ngồi ra, Trifluralin cịn ảnh hưởng đến quá trình phát triển phơi và làm giảm sinh trưởng của thế hệ con. . Trifluralin được cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ (EPA) xếp vào nhóm C, có thể gây ung thư với người . Nhóm tư vấn về sức khỏe cuộc sống của EPA cho rằng hàm lượng của Trifluralin trong nước uống là 5 µ/lít nước uống bao gồm mức an toàn.
Tác nhân gây ung thƣ: Một cuộc nghiên cứu trên 2 năm trên chuột với lượng
325 mg/kg mỗi ngày, số lượng các u bướu ác tính phát triển trên bàng quang, thận và tuyến giáp tăng. Lượng Trifluralin được hấp thụ phân bố nhiều nhất trong mô mỡ, thận, gan, tuyến thượng thận và máu. Trong cơ thể Trifluralin có thể chuyển hóa qua các phản ứng khử nitro (nitroreduction), khử alkyl (N-dealkylation), hydroxyl hóa (hydroxylation) và phản ứng tạo vịng (cyclization) (EU DAR, 2005). Một nghiên cứu ở Hoa Kỳ cho rằng sử dụng Trifluralin có thể làm tăng rủi ro mắc
bệnh ung thư bạch huyết (non-Hodgkin lymphoma). Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu ảnh hưởng của Trifluralin lên sức khỏe của người cho thấy chưa có bằng chứng rõ ràng về liên quan của Trifluralin với bệnh ung thư. Mặc dù vậy, nhưng dựa trên các kết quả nghiên cứu trên động vật, các nhà nghiên cứu vẫn cho rằng Trifluralin có thể gây bệnh ung thư trên người. Do đó, nhiều quốc gia đã cấm hoặc hạn chế sử dụng. Hầu hết các quốc gia ở Châu Âu, Châu Mỹ, Nhật Bản quy định dư lượng của Trifluralin khơng được vượt q 10µg/kg trong thịt và 1µg/kg trong cá. Tiêu chuẩn cho nước uống phải có hàm lượng Trifluralin nhỏ hơn 5µg/kg. Ở Việt Nam, Trifluralin bị cấm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản theo thông tư số 20/2010/TT-BNNPTNT ngày 02/04/2010. Tóm lại, Trifluralin rất độc cho sức khỏe của người và động vật, dư lượng của chúng trong mơi trường có thể ảnh hưởng đến sự đa dạng sinh học. Vì vậy, khơng nên sử dụng loại hóa chất này trong sản xuất nông nghiệp.
2.6. Tác động đến môi trƣờng.
Sự phân tán trong đất và nƣớc mặt: Trifluralin có độ bền thấp hay cao trong mơi
trường đất tùy thuộc vào điều kiện môi trường. Trong đất Trifluralin được phân hủy bởi vi sinh vật. Dư lượng Trifluralin trên mặt đất sau khi sử dụng sẽ bị phân hủy bởi tia UV hoặc sẽ bị bay hơi. Chu kỳ bán hủy của Trifluralin trong đất là 45 đến 60 ngày trong 6 tới 8 tháng. Sau 6 tháng tới 1 năm, 80% – 90% dư lượng sẽ bị loại bỏ. Trifluralin hấp thụ mạnh trong đất nhưng khơng hịa tan trong nước.
Sự phân tán trong nƣớc: Trifluralin khơng hịa tan trong nước nên chúng hầu hết
được tìm thấy trong trầm tích hay các hạt lơ lửng trong nước.
Sự phân tán trong thực vật: Trifluralin kiềm chế sự sinh trưởng của rễ và chồi
sau khi được hấp thụ lên các hạt vừa nảy mầm. Dư lượng Trifluralin trên cây trồng được tìm thấy trong rễ, chúng khơng tồn tại trong lá, hạt hoặc quả của cây. Trên hầu hết các cánh đồng đều khơng có tác dụng trên lá, nhưng đối với thuốc lá và bí thì có thể phát hiện Trifluralin trên lá.
CHƢƠNG 3: TỔNG QUAN VỀ HỆ THỐNG GC VÀ ĐẦU DÒ ECD.[2]
3.1. Hệ thống sắc ký khí – GC.
3.1.1. Giới thiệu về sắc ký khí.
Sắc ký khí được biết từ năm 1906 nhưng mãi đến năm 1952, kỹ thuật này mới được phát triển mạnh mẽ, nhất là trong thập niên 1960.
Sắc ký khí là kỹ thuật phân tích hiêu quả với độ phân giải cao, có thể giúp khảo sát một mẫu chất có trọng lượng vài miligam và đội khi chỉ vài microgram, có thể phân tích một hỗn hợp mẫu chất phức tạp và có thể phân tích định lượng.
Kỹ thuật sắc ký khí được sử dụng để phân tích một lượng rất lớn một lượng rất lớn những hợp chất hữu cơ khác nhau, các hợp chất đó có thể là chất khí hoặc chất lỏng, đơi khi là chất rắn. Tuy nhiên, đối với các hợp chất không bền nhiệt, kém bay hơi (trọng lượng phân tử lớn hơn 300 amu) hoặc loại hợp chất ion, kỹ thuật sắc ký khí khơng thể phân tích mẫu trực tiếp được mà cần phải biến đổi các hợp chất nói trên thành các hợp chất có tính bay hơi, mới có thể phân tích bằng sắc ký khí.
(a) (b)
3.1.2. Các bộ phận của hệ thống sắc kí khí.
Hình 10: Sơ đồ cấu tạo của hệ thống sắc ký khí – GC.
3.1.2.1. Khí mang (carrier gas).
Khí mang cịn được gọi là khí vecto. Trong sắc ký khí, khí mang đóng vai trị là pha động để vận chuyển các thành phần mẫu phân tích xuyên ngang cột sắc ký, đến bộ phận phát hiện tín hiệu.
Bảng 6: Độ nhớt và độ dẫn nhiệt của một số khí dùng làm khí mang.
Khí mang Trọng lƣợng phân tử Độ nhớt (µp) Độ dẫn nhiệt (cal.s-1cm-2.ºC-1.cm-1)x10-6 CO2 44 189 42 Ar 40 269 44 O2 32 256 66 Van khí Bình chứa khí Hệ thống tiêm mẫu Buồng tiêm mẫu Hệ thống nhận tín hiệu Detector Buồng sắc ký Cột sắc ký Sắc ký đồ
N2 28 219 64
He 4 228 369
H2 2 108 459
Metan 16 - 86
Etanol 46 - 35
Nguồn: Nguyễn Kim Phi Phụng (2002), Phương pháp cơ lập các hợp chất hữu cơ.
Khí mang được cung cấp bởi một bình có áp suất cao, lên đến 300 psi (20,7 MPa). Khí mang phải có độ tinh khiết 99,999%.
3.1.2.2. Bộ phận đƣa mẫu vào máy.
Bộ phận đưa mẫu vào máy là nơi mà mẫu từ bên ngoài được đưa vào bên trong máy sắc ký. Bộ phận này gồm ống bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ, một đầu nối vào bên trong máy sắc ký, còn đầu kia tiếp xúc với bên ngồi; đầu này có gắn một nút bằng cao su silicon dầy 2,3 – 3,2 mm (septum).
3.1.2.3. Cột sắc ký.
Cột sắc ký đặc biết rất dài. Loại cột nhồi pha tính thường có đường kính trong 2 – 6 mm và dài 1 – 3 m. Loại cột mao quản thường có đường kính trong 0,2 – 0,7 mm và dài 10 – 100 m. Cột dài được cuộn thành các khoanh trịn có đường kính 10 – 20 cm.
(a) (b)
Hình 11 : (a) Cột nhồi, (b) Cột mao quản.
- Đầu dò dẫn nhiệt (Thermal conductivity detector, TCD). - Đầu dị ion hóa ngọn lửa (Flame ionization detector, FID). - Đầu dò bắt điện tử (Electron capture detector, ECD).
- Đầu dò Nitrogen – phosphor (Nitrogen – phosphorous detector, NPD). - Đầu dò trắc quang ngọn lửa (Flame photometric detector, FPD). - Đầu dị quang ion hóa (Photoionisation detector, PID).
- Đầu dị phức hợp (miscellaneous detector)
Ngồi ra, ngày nay người ta còn kêt hợp GC với MS và IR thành hệ thống GC/MS và GC/IR.
3.1.3. Cơ chế hoạt động.
Trong sắc ký khí, pha động là một chất khí thường được gọi là khí mang. Khí này xuất phát từ một bình khí nén thành một dịng khí có thể điều chỉnh lưu lượng bởi những van khóa, để đi vào một cột có chứa pha tĩnh. Tại cột này, các thành phần khác nhau của hỗn hợp mẫu khảo sát được tách riêng ra. Mẫu chất khảo sát hoặc các hợp chất chuẩn được chích vào dịng khí mang tại một vị trí ở đầu cột pha tĩnh, rồi đi ngang qua pha tĩnh được tách thành các hợp chất riêng rẽ và ra khỏi cột. Các hợp chất khác nhau của hỗn hợp mẫu chất ban đầu được bộ phận phát hiện ghi nhận (bằng các tín hiệu điện tử) và giao diện của máy biến đổi tín hiệu đó thành các mũi xuất hiện trên sắc ký đồ.
3.2. Detector bắt điện tử - ECD (Electron Capture Detector).
Cấu tạo và cơ chế hoạt động.
Detector gồm có điện trường, bên trong có nguồn phát tia β (do Ni63, được phủ bên ngồi tấm bạch kim hay titan), khí mang được dùng là Ar. Điện tử sơ cấp của tia β sẽ ion hóa phân tử khí mang làm bắn ra điện tử thứ cấp, tạo dòng điện trong điện trường, phản ứng dây chuyền xảy ra. Khi có sự hiện diện của mẫu, thường là chất có độ âm điện cao, sẽ nhận điện tử thứ cấp, làm giảm cường độ dòng điện, tương ứng với sự xuất hiện mũi sắc kí.
Hình 12 : Cấu tạo của đầu dò ECD.
Đặc điểm:
Độ nhạy cao, nhất là khi mẫu thuộc các nhóm chức: halogenua, peroxid, quinon, nitro…Đặc biệt dùng phân tích thuốc sát trùng.
Nhưng để độ nhạy cao, phải dùng khí Ar (giá trị cao), vì N2 có độ liên kết khá bền nên khó tạo điện tử thứ cấp.
Do đặc tính bắt điện tử nên có thể dùng để xác định Trifluralin với độ nhạy rất cao do Trifluralin có chứa Flo là nguyên tố có độ âm điện thấp.
Nguồn Ni 63
C: PHẦN THỰC NGHIỆM
CHƢƠNG 4: PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
4.1. Thời gian và địa điểm.
- Thời gian: Từ 12/2010 – 5/2011.
- Địa điểm: Phịng Lab, cơng ty INTERTEK CAN THO.
4.2. Thiết bị và dụng cụ
- Máy lắc Thermo Scientific. - Máy ly tâm Hettick Gentrifugen.
- Hệ thống cô quay chân không Heidolph. - Bể siêu âm Elma S 180H.
- Hệ thống GC - µECD Agilent technologies7890A. - Cột DB – 5MS, dài 30m, 250µm, 25x10-2µm Agilent.
- Hệ thống tiêm mẫu tự động Autosampler Agilent technologies 7693. - Lò nung Carbolite.
- Bông thủy tinh (glasswolle extrafein) của Đức. - Ống tiêm y tế Vinahankook loại 10cc.
- Micropipet 5 - 50µL, 20 - 100µL, 100 – 1000µL, 1000 - 5000µL Gilson hoặc tương đương.
- Máy xay mẫu. Bình cầu 250mL. - Quả lê 50mL.
- Bình định mức 10, 20, 50, 100mL. - Vial 1,5mL.
- Cân kĩ thuật chính xác 0,001g. - Cân phân tích chính xác 0,0001g.
4.3. Hóa chất.
- Sodium sulfate anhydrous for analysis (Merck). - Hexanes (J.T.Baker).
- Acetone (J.T.Baker).
CHƢƠNG 5: PHƢƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM
5.1. Phƣơng pháp tham khảo:
“Xác định dư lượng 25 loại thuốc bảo vệ thực vật trong ếch và cá bằng GC/MS
(SIM)” của Ueon-Sang Shin và Ho-Sang Shin (2003), tạp chí Korean chem, vol 4, No 4, trang 413 - 419.
Giới hạn phát hiện của phương pháp này là 0,3 ng/g đối với Trifluralin.
Hệ thống GC/MS Agilent 6890/5973 N.
Điều kiện chạy máy: EI, 70eV, 230ºC. Phổ MS được quét trong vùng 40-800 m/z.
5.2. Đánh giá phƣơng pháp tham khảo.
- Do điều kiện phịng thí nghiệm của cơng ty có 1 hệ thống GC/MS, nhưng hệ thống này đang bị quá tải do số lượng mẫu các chỉ tiêu khác nhau quá nhiều. Trong khi đó cơng ty vẫn có 3 hệ thống GC/ECD nên đã xây dựng lại phương pháp xác định chỉ tiêu Trifluralin để có thể phân tích trên GC/µECD.
5g mẫu + 100µL dd chuẩn EDS (50ng/ml) Thêm 25mL Acetonitril:Acetone (1:1) và 20µ phenatren d10 trong Acetone (5000ng/ml)
Siêu âm 5 phút, tách lấy dung dịch, phần xác thêm 5mL ACN:Acetone (1:1) , siêu âm 5 phút, cô quay.
Thêm 10mL n-Hexane ta được dịch chiết . Chuẩn bị cột SPE: 2,5g Florisil +5g Silicagel + 2g Na2SO4 Kích hoạt cột bằng 10mL n-Hexane, tốc độ dung mơi
qua cột là 10ml/phút
Cho dịch chiết mẫu qua cột.
Rửa giải lại cột với 50mL n-Hexane:Acetone (9:1),
tốc độ rửa giải là 0,5mL/phút.
Làm khan với 10g Na2SO4.
Cô quay đến khi cạn dung mơi và hịa tan lại với
100µL n-Hexane và chuyển vào Vial.
- Tăng lượng mẫu cân lên thành 10g để tăng thêm độ nhậy. - Tăng số lần chiết lên 2 lần để tăng hiệu suất thu hồi.
- Không dùng phương pháp nội chuẩn vì điều kiện phịng thí nghiệm khơng sử dụng nội chuẩn cho Trifluralin.
- Do Acetonitril hút nước rất tốt làm mẫu thủy sản dễ bị cứng lại nên thay đổi hệ dung môi chiết từ Acetonitrile : Acetone (1:1) thành n-Hexane:Acetone. n-Hexane thì khơng hút nước và mẫu thủy sản không bị cứng lại, có thể chiết tốt hơn.
- Thêm 10g Na2SO4 để loại nước ngay trong quá trình chiết. - Sử dụng cột Florisil để loại màu và tạp chất tốt hơn.
5.3. Hoạch định thí nghiệm.
5.3.1. Khảo sát lại quy trình tham khảo trong điều kiện phịng thí nghiệm cơng ty INTERTEK CAN THO: cơng ty INTERTEK CAN THO:
- Thí nghiệm 1: Khảo sát độ tuyến tính trong khoảng 1 -20ppb. - Thí nghiệm 2: Khảo sát lại tỉ lệ hệ dung môi chiết.
- Thí nghiệm 3: Khảo sát thể tích dung mơi tối ưu cho 1 lần chiết. - Thí nghiệm 4: Khảo sát thời gian tối ưu cho 1 lần chiết.
- Thí nghiệm 5: Khảo sát lại tỉ lệ hệ dung môi rửa cột.
5.3.2. Thẩm định quy trình đã đƣợc phát triển lại:
- Thí nghiệm 6: Khảo sát độ tuyến tính.
- Thí nghiệm 7: Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ). - Thí nghiệm 8: Khảo sát độ lặp lại.
- Thí nghiệm 9: Khảo sát độ tái lặp. - Thí nghiệm 10: Khảo sát độ thu hồi.
5.3.3. Tiến hành thử nghiệm trên mẫu thật.
Thí nghiệm 11: Xác định hàm lượng Trifluralin trên 6 mẫu cá của công ty AGIFISH.
5.4.1. Khảo sát lại quy trình tham khảo.
5.4.1.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát độ tuyến tính trong khoảng 1 – 20ppb. a. Mục đích: a. Mục đích:
Xây dựng đường chuẩn chung dùng để tính tốn kết quả trong các thí nghiệm 2, 3, 4, 5, 6 tiếp theo.
b. Pha các dung dịch chuẩn
- Pha dunh dịch chuẩn trung gian 1ppm từ dung dịch chuẩn gốc 1000ppm: Dùng micropipet 100µL hút 10µL dung dịch chuẩn gốc. Cho vào ống pha chuẩn đã có sẵn 10mL Hexan. Lắc xoáy kĩ ống pha chuẩn.
- Pha dung dịch chuẩn làm việc 1ppb từ dung dịch chuẩn trung gian: Dùng micropipet 50µL hút 10µL dung dịch chuẩn trung gian cho vào ống pha chuẩn có sẵn 10mL Hexan. Lắc xốy kĩ ống pha chuẩn.
- Pha dung dịch chuẩn làm việc 2ppb từ dung dịch chuẩn trung gian: Dùng micropipet 50µL hút 20µL dung dịch chuẩn trung gian cho vào ống pha chuẩn có sẵn 10mL Hexan. Lắc xốy kĩ ống pha chuẩn.
- Pha dung dịch chuẩn làm việc 4ppb từ dung dịch chuẩn trung gian: Dùng micropipet 50µL hút 40µL dung dịch chuẩn trung gian cho vào ống pha chuẩn có sẵn 10mL Hexan. Lắc xoáy kĩ ống pha chuẩn.
- Pha dung dịch chuẩn làm việc 10ppb từ dung dịch chuẩn trung gian: Dùng micropipet 100µL hút 100µL dung dịch chuẩn trung gian cho vào ống pha chuẩn có sẵn 10mL Hexan. Lắc xốy kĩ ống pha chuẩn.