CHƢƠNG 5 : PHƢƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM
5.4. Tiến hành thí nghiệm
5.4.1.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát tỉ lệ hệ dung môi Hexane:Acetone
a. Mục đích: y = 14,991,901.38x + 5,931,047.13 R² = 1.00 0 50000000 100000000 150000000 200000000 250000000 300000000 350000000 0 5 10 15 20 25 D iệ n t íc h p e ak Nồng độ thêm vào
Tìm tỉ lệ hệ dung mơi Hexane:Acetone có hiệu suất chiết tối ưu, từ đó áp dụng cho quy trình phát triển lại.
b. Pha các hệ dung môi và dung dịch chuẩn làm việc.
- Pha dung dịch chuẩn làm việc 100ppb từ dung dịch chuẩn trung gian: Dùng
micropipet 1000µL hút 1000µL dung dịch chuẩn trung gian cho vào ống pha chuẩn có sẵn 10mL Hexan. Lắc xoáy kĩ ống pha chuẩn.
- Pha hệ dung môi Hexan:Acetone (1:4): Dùng ống đong 50mL, đong chính xác
50mL Hexane cho vào bình định mức. Dùng ống đong 250mL, đong chính xác 200mL Acetone cũng cho vào bình định mức trên. Tiến hành siêu âm trong 15 phút.
- Pha hệ dung môi Hexan:Acetone (1:3): Dùng ống đong 50mL, đong chính xác
50mL Hexane cho vào bình định mức. Dùng ống đong 250mL, đong chính xác 150mL Acetone cũng cho vào bình định mức trên. Tiến hành siêu âm trong 15 phút.
- Pha hệ dung môi Hexan:Acetone (1:2): Dùng ống đong 50mL, đong chính xác
50mL Hexane cho vào bình định mức. Dùng ống đong 100mL, đong chính xác 100mL Acetone cũng cho vào bình định mức trên. Tiến hành siêu âm trong 15 phút.
- Pha hệ dung môi Hexan:Acetone (1:1): Dùng ống đong 100mL, đong chính xác
100mL Hexane cho vào bình định mức. Dùng ống đong 100mL, đong chính xác 100mL Acetone cũng cho vào bình định mức trên. Tiến hành siêu âm trong 15 phút.
- Pha hệ dung môi Hexan:Acetone (2:1): Dùng ống đong 100mL, đong chính xác
100mL Hexane cho vào bình định mức. Dùng ống đong 50mL, đong chính xác 50mL Acetone cũng cho vào bình định mức trên. Tiến hành siêu âm trong 15 phút.
- Pha hệ dung môi Hexan:Acetone (3:1): Dùng ống đong 250mL, đong chính xác
150mL Hexane cho vào bình định mức. Dùng ống đong 50mL, đong chính xác 50mL Acetone cũng cho vào bình định mức trên. Tiến hành siêu âm trong 15 phút.
- Pha hệ dung môi Hexan:Acetone (4:1): Dùng ống đong 250mL, đong chính xác
200mL Hexane cho vào bình định mức. Dùng ống đong 50mL, đong chính xác 50mL Acetone cũng cho vào bình định mức trên. Tiến hành siêu âm trong 15 phút.
Tiến hành thay đổi hệ dung môi Acetonitril:Acetone (1:1) thành hệ dung môi Hexane:Acetone với tỉ lệ thể tích khác nhau, thêm 100µL dung dịch chuẩn 100ppb vào, để yên 15 phút và tiến hành chiết, xác định lại hàm lượng Trifluralin đã thêm vào bằng GC/ECD, tính hiệu suất thu hồi từ đó suy ra tỉ lệ tối ưu.
Cân 10g mẫu thêm 10g Na2SO4. ↓
Thêm 25mL Hexane:Acetone với tỉ lệ hệ dung môi khác nhau.
↓
Làm đồng nhất và tiến hành siêu âm trong 5 phút. ↓ Chiết 2 lần
Tách lấy phần dung dịch, cơ quay đến khi cịn lại khoảng 0,5mL. ↓
Hòa tan lại với 10 n-Hexane. ↓
Làm sạch bằng cột SPE.
(Cho vào ống tiêm theo thứ tự 2,5g Florisil, 5g Silicagel và 2g Na2SO4). ↓
Cơ quay đến khi cạn dung mơi và hịa tan lại với 100µL n-Hexane và chuyển vào Vial.
↓
Tiến hành chạy GC/µECD.
d. Kết quả.
Bảng 8: Bảng kết quả thí nghiệm 2
Tỉ lệ Hexan:Aceton (v:v) 1:4 1:3 1:2 1:1 2:1 3:1 4:1
Nồng độ thu hồi (ppb) 0.4 0.6 0.7 0.66 0.56 0.46 0.4
Hình 14: Biểu đồ tƣơng quan hiệu suất thu hồi và tỉ lệ hệ dung môi.
Kết luận: Tỉ lệ hệ dung mơi Hexane:Acetone chiết có hiệu suất thu hồi tốt nhất là
1:2.
5.4.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát thể tích chiết tối ƣu. a. Mục đích:
Tìm thể tích hệ dung mơi chiết có hiệu suất thu hồi tốt nhất, từ đó áp dụng vào quy trình sẽ phát triển lại.
b. Pha hệ dung môi Hexan:Acetone (1:2) và dung dịch chuẩn.
- Pha hệ dung môi Hexan:Aceton (1:2): Dùng ống đong 100mL, đong chính xác
100mL Hexane cho vào bình định mức. Dùng ống đong 200mL, đong chính xác 200mL Acetone cho vào bình định mức đã có Hexane. Tiến hành siêu âm 15 phút.
- Pha dung dịch chuẩn làm việc 100ppb từ dung dịch chuẩn trung gian: Dùng
micropipet 1000µL hút 1000µL dung dịch chuẩn trung gian cho vào ống pha chuẩn có sẵn 10mL Hexan. Lắc xoáy kĩ ống pha chuẩn.
c. Thực nghiệm.
Tiến hành chiết với thể tích hệ dung mơi Hexane:Acetone (1:2) thay đổi, xác định lại hàm lượng Trifluralin đã thêm vào (100µL dung dịch chuẩn 100ppb) từ đó suy ra thể tích của hệ dung mơi chiết có hiệu suất thu hồi tốt nhất.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 1 2 3 4 5 6 7 8 H iệ u su ất % tỉ lệ 1:4 1:3 1:2 1:1 2:1 3:1 4:1
Cân 10g mẫu thêm 10g Na2SO4. ↓
Thêm Hexane:Acetone (1:2) với thể tích dung mơi khác nhau.
↓
Làm đồng nhất và tiến hành siêu âm trong 5 phút. ↓ Chiết 2 lần
Tách lấy phần dung dịch,
cơ quay đến khi cịn lại khoảng 0,5mL. ↓
Hòa tan lại với 10 n-Hexane. ↓
Làm sạch bằng cột SPE.
(Cho vào ống tiêm theo thứ tự 2,5g Florisil, 5g Silicagel và 2g Na2SO4). Cơ quay đến khi cạn dung mơi và hịa tan lại với 100µL n-Hexane và chuyển
vào Vial. ↓
Tiến hành chạy GC/µECD.
d. Kết quả.
Bảng 9: Bảng kết quả thí nghiệm 3
Thể tích (mL) 10 15 20 25 30 35 40
Nồng độ thu hồi (ppb) 0.635 0.655 0.675 0.7 0.7 0.698 0.7
Hình 15: Biểu đồ hiệu suất thu hồi tƣơng ứng với thể tích dung mơi.
Kết luận: Thể tích hệ dung mơi Hexane:Acetone chiết có hiệu suất thu hồi tốt nhất
là 25mL.
5.4.1.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát hiệu quả thời gian chiết. a. Mục đích. a. Mục đích.
Tìm thời gian cho 1 lần chiết có hiệu suất thu hồi tốt nhất.
b. Pha hệ dung môi Hexan:Aceton (1:2) và dung dịch chuẩn làm việc.
- Pha hệ dung môi Hexan:Acetone (1:2): Dùng ống đong 100mL, đong chính xác
100mL Hexane cho vào bình định mức. Dùng ống đong 200mL, đong chính xác 200mL Acetone cũng cho vào bình định mức trên. Tiến hành siêu âm trong 15 phút.
- Pha dung dịch chuẩn làm việc 100ppb từ dung dịch chuẩn trung gian: Dùng
micropipet 1000µL hút 1000µL dung dịch chuẩn trung gian cho vào ống pha chuẩn có sẵn 10mL Hexan. Lắc xoáy kĩ ống pha chuẩn.
c. Thực nghiệm.
Tiến hành chiết mẫu với 25mL Hexane:Acetone (1:2), thay đổi thời gian mỗi lần siêu âm. Xác định lại hàm lượng Trifluralin đã thêm vào (100µL dung dịch chuẩn 100ppb) từ đó cho thấy thời gian chiết tối ưu.
Cân 10g mẫu thêm 10g Na2SO4.
60 62 64 66 68 70 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 H iệ u su ất % Thể tích mL
↓
Thêm 25mL Hexane:Acetone (1:2). ↓
Làm đồng nhất và tiến hành siêu âm với thời gian thay khác nhau.
↓ Chiết 2 lần Tách lấy phần dung dịch,
cơ quay đến khi cịn lại khoảng 0,5mL. ↓
Hòa tan lại với 10 n-Hexane. ↓
Làm sạch bằng cột SPE.
(Cho vào ống tiêm theo thứ tự 2,5g Florisil, 5g Silicagel và 2g Na2SO4). ↓
Cô quay đến khi cạn dung mơi và hịa tan lại với 100µL n-Hexane và chuyển vào Vial.
↓
Tiến hành chạy GC/µECD.
d. Kết quả.
Bảng 10: Bảng kết quả thí nghiệm 4
Thời gian (phút) 10 20 30 40 50 60
Hình 16: Biểu đồ hiệu suất phụ thuộc vào thời gian chiết.
Kết luận: Thời gian chiết có hiệu suất thu hồi tối ưu là 40 phút.
5.4.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát tỉ lệ hệ dung môi Hexane:Acetone rửa giải cột SPE. a. Mục đích. a. Mục đích.
Tìm tỉ lệ Hexane:Acetone cho q trình rửa giải có hiệu suất thu hồi tối ưu.
b. Pha các hệ dung môi.
- Pha dung dịch chuẩn làm việc 100ppb từ dung dịch chuẩn trung gian: Dùng
micropipet 1000µL hút 1000µL dung dịch chuẩn trung gian cho vào ống pha chuẩn có sẵn 10mL Hexan. Lắc xốy kĩ ống pha chuẩn.
- Pha hệ dung môi Hexane:Acetone (1:2): dùng ống đong 250mL đong chính xác
200mL Hexane cho vào bình định mức, tiếp tục đong 200mL Acetone cho vào bình định mức, tiến hành siêu âm 15 phút.
- Pha hệ dung môi Hexane:Acetone (9:1): dùng ống đong 100mL đong chính xác
90mL Hexane cho vào bình định mức, tiếp tục đong 10mL Acetone cho vào bình định mức, tiến hành siêu âm 15 phút.
- Pha hệ dung môi Hexane:Acetone (8:2): dùng ống đong 100mL đong chính xác
80mL Hexane cho vào bình định mức, tiếp tục đong 20mL Acetone cho vào bình định mức, tiến hành siêu âm 15 phút.
40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 H ie u su at
- Pha hệ dung môi Hexane:Acetone (7:3): dùng ống đong 100mL đong chính xác
70mL Hexane cho vào bình định mức, tiếp tục đong 30mL Acetone cho vào bình định mức, tiến hành siêu âm 15 phút.
- Pha hệ dung môi Hexane:Acetone (6:4): dùng ống đong 100mL đong chính xác
60mL Hexane cho vào bình định mức, tiếp tục đong 40mL Acetone cho vào bình định mức, tiến hành siêu âm 15 phút.
- Pha hệ dung môi Hexane:Acetone (5:5): dùng ống đong 100mL đong chính xác
50mL Hexane cho vào bình định mức, tiếp tục đong 50mL Acetone cho vào bình định mức, tiến hành siêu âm 15 phút.
c. Thực nghiệm.
Tiến hành thí nghiệm với 6 mẫu, chiết với 25mL Hexane:Acetone (1:2). Rửa giải cột SPE bằng hệ dung môi Hexane:Acetone với tỉ lệ khác nhau. Xác định lại hàm lượng Trifluralin đã thêm vào (100µL dung dịch chuẩn 100ppb), suy ra tỉ lệ hệ dung mơi tối ưu có thể sử dụng để rửa giải qua cột SPE.
Cân 10g mẫu thêm 10g Na2SO4. ↓
Thêm 25mL Hexane:Acetone (1:2). ↓ chiết lần 1
Làm đồng nhất và tiến hành siêu âm trong 40 phút. ↓ Chiết 2 lần
Gom dịch chiết lại, cô quay đến khi còn lại khoảng 0,5mL. ↓
Hòa tan lại với 10 n-Hexane. ↓
Làm sạch bằng cột SPE.
(Cho vào ống tiêm theo thứ tự 2,5g Florisil, 2g Na2SO4). ↓
Rửa giải lại cột với 50mL n-Hexane:Acetone với tỉ lệ hệ dung môi khác nhau, tốc độ rửa giải là 0,5mL/phút.
↓
Cô quay đến khi cạn dung mơi và hịa tan lại với 100µL n-Hexane và chuyển vào Vial.
↓
Tiến hành chạy GC/µECD.
d. Kết quả.
Bảng 12: Bảng kết quả thí nghiệm 6
Tỉ lệ Hexane:Acetone (v:v) 9:1 8:2 7:3 6:4 5:5
Hiệu suất thu hồi % 67 72 76 71 53
Hình 17: Biểu đồ hiệu suất thu hồi phụ thuộc vào tỉ lệ dung môi rửa giải cột SPE.
Kết luận: Hệ dung mơi Hexane:Acetone rửa giải cột SPE có hiệu suất thu hồi tối
ưu với tỉ lệ là 7:3 (v:v).
5.4.2. Phát triển phƣơng pháp xác định Trifluralin trong thủy sản
GC/µECD và thẩm định quy trình đã xây dựng[1].
Phƣơng pháp. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 1 2 3 4 5 6 H iệ u su ất % Tỉ lệ dung môi 9:1 8:2 7:3 6:4 5:5
Điều kiện chạy máy GC/µECD.
- Sample inlet: GC.
- Injection source: GCALS. - Oven: on.
- Equilibration time: 2 min.
- Oven program: 80oC for 0 min. Sau đó tăng 20oC/phút tới 165oC giử 1 phút.
Sau đó tăng 1,5o
C/phút tới 180oC giử 0 phút. Sau đó tăng 100oC/phút tới 300oC giử 3,55 phút. - Post run temp: 300oC.
Front Injection:
- Syinge size: 10µL. - Injection volume: 1µL. - Injection repetitions: 1. - Solven A washes (pre inj): 0. - Solven A washes (post inj): 3. - Solven volume A: 8µL.
10g mẫu + 10g Na2SO4
Thêm 25mL
Hexane:Acetone (1:2)
Siêu âm 40phút, tách lấy dung dịch, phần xác thêm
25mL Hexane:Acetone (1:2) , siêu âm 40 phút, cô
quay. Thêm 10mL n-Hexane ta được dịch chiết . Chuẩn bị cột SPE: 5g Florisil + 3g Na2SO4 Kích hoạt cột bằng 10mL n-Hexane, tốc độ dung môi
qua cột là 10ml/phút
Cho dịch chiết mẫu qua cột.
Rửa giải lại cột với 50mL n-Hexane:Acetone (7:3),
tốc độ rửa giải là 0,5mL/phút.
Cô quay đến khi cạn dung mơi và hịa tan lại với
100µL n-Hexane và chuyển vào Vial.
- Sample wash: 3.
Front inlet SS:
- Heater: on 250oC. - Pressure: on 11,986psi. - Total flow: on 20,928ml/min. - Septum purge flow: on 3ml/min. - Mode: split.
- Gas saver: on 20mL/min after 3 min. - Split ratio: 20:1.
- Split flow: 17,075mL/min.
Front detector µECD.
- Heater: on 300oC.
- Makeup flow (N2): on 45mL/min. - Electrometer: off.
Signal:
- Front signal: Save on 50Hz/0,04min.
Tính kết quả: m V C C x. Với: - C (ppb): Nồng độ cần xác định.
- Cx (ppb): Nồng độ đo được bằng GC/µECD. - V (µL): Thể tích cuối cùng được đo.
- m (g): Khối lượng mẫu đem phân tích.
5.4.2.1. Thí nghiệm 6: Thí nghiệm về độ tuyến tính của quy trình đã phát triển . a. Mục đích.
Xây dựng đường chuẩn, khảo sát độ tuyến tính, xác định hệ số tương quan R2. Đường chuẩn này dùng để tính kết quả trong các thí nghiệm 7, 8, 9, 10, 11.
b. Pha các hệ dung môi và dung dịch chuẩn làm việc.
- Pha hệ dung môi Hexan:Aceton (1:2): dùng ống đong 250mL đong chính xác 200mL Hexane cho vào bình định mức, tiếp tục đong 200mL Acetone cho vào bình định mức, tiến hành siêu âm 15 phút.
- Pha dung dịch chuẩn làm việc 100ppb từ dung dịch chuẩn trung gian: Dùng
micropipet 1000µL hút 1000µL dung dịch chuẩn trung gian cho vào ống pha chuẩn có sẵn 10mL Hexan. Lắc xoáy kĩ ống pha chuẩn.
c. Thực nghiệm.
Tiến hành thí nghiệm với 5 mẫu từ S1 tới S5, nồng độ thêm vào tương ứng là 0.3ppb (30µL dung dịch 100ppbs), 0.6ppb (60µL dung dịch 100ppb), 1.2ppb (120µL dung dịch 100ppb), 1.8ppb (180µL dung dịch 100ppb), 3.0ppb (300µL dung dịch 100ppb). Tiến hành xác định lại nồng độ bằng GC/µECD. Xác định độ tuyến tính.
d. Kết quả.
Bảng 13: Bảng kết quả thí nghiệm 7
Nồng độ (ppb) 0.3 0.6 1.2 1.8 3
Hình 18: Đồ thị tuyến tính của quy trình đã xây dựng.
Kết luận: Phương trình đường chuẩn dựng được là:
Y = 5093456,69*x + 1542447,16 Hệ số R2 = 1,00
5.4.2.2. Thí nghiệm 7:Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ).
a. Mục đích.
Tìm giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện của phương pháp.
Phương sai: ) 1 ( ) ( ) ( 1 2 n x x x D n i Độ lệch chuẩn: (x) D(x)
Độ lệch chuẩn tương đối: RSD = (σ(x)/x)*100 LOD = (x)*3 LOQ = (x)*10 y = 5,093,456.69x + 1,542,447.16 R² = 1.00 0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000 14000000 16000000 18000000 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 D iệ n t íc h p e ak Nồng độ (ppb)
b. Pha hệ dung mơi và dung dịch chuẩn làm việc.
- Pha hệ dung môi Hexan:Aceton (1:2): dùng ống đong 250mL đong chính xác 200mL Hexane cho vào bình định mức, tiếp tục đong 200mL Acetone cho vào bình định mức, tiến hành siêu âm 15 phút.
- Pha dung dịch chuẩn làm việc 100ppb từ dung dịch chuẩn trung gian: Dùng
micropipet 1000µL hút 1000µL dung dịch chuẩn trung gian cho vào ống pha chuẩn có sẵn 10mL Hexan. Lắc xốy kĩ ống pha chuẩn.
c. Thực nghiệm.
Thực hiện thí nghiệm với 6 mẫu cá, tôm, mực với nồng độ thêm vào là 1ppb. Xác định lại bằng GC/µECD. Xác định phương sai, độ lệch chuẩn, LOD và LOQ theo công thức. d. Kết quả. Bảng 14: Bảng kết quả thí nghiệm 7 Mẫu Cá Tơm Mực Nồng độ thu hồi x (ppb) 1.01 0.99 0.99 0.98 0.97 0.96 0.98 1.01 0.99 0.99 0.98 1.02 1.00 0.97 0.96 0.96 1.00 0.99 Nồng độ trung bình x (ppb) 0.987 0.987 0.985 Độ lệch chuẩn (x) 0.018 0.016 0.023
Độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD (%) 1.775 1.655 2.293
LOD (ppb) 0.06
Kết luận: Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,06ppb, giới hạn định lượng của
phương pháp là 0,19 ppb.
5.4.2.3. Thí nghiệm 8: Khảo sát độ lặp lại. a. Mục đích. a. Mục đích.
Tìm độ lặp lại của phương pháp, biểu thị mức độ chính xác của phương pháp được tiến hành bởi cùng một người, cùng một phịng thí nghiệm trên cùng một dụng cụ máy moc trong cùng một thời gian.
b. Pha hệ dung môi và dung dịch chuẩn làm việc.
- Pha hệ dung môi Hexan:Aceton (1:2): dùng ống đong 250mL đong chính xác 200mL Hexane cho vào bình định mức, tiếp tục đong 200mL Acetone cho vào bình định mức, tiến hành siêu âm 15 phút.
- Pha dung dịch chuẩn làm việc 100ppb từ dung dịch chuẩn trung gian: Dùng