c. Quy trình chiết tách 3
Nguyên tắc và các thao tác thực hiện chiết tách
Nguyên tắc: Dichlorvos được ly trích khỏi sản phẩm thủy sản bằng
dung dịch Ethyl acetate. Dịch chiết được làm sạch bằng cột SPE. Dịch chiết
sau đó được cơ quay đến khơ ở 45 C. Dịch chiết thu được cho qua đầu lọc 0,2 m rồi đem phân tích bằng GC-ECD.
Chuẫn bị mẫu: Mẫu nước được lọc qua giấy lọc. Bảo quản dung dịch
trong tủ đông (-20 oC) đến khi sử dụng. Khi sử dụng, mẫu nước đã được rã đơng hồn tồn.
Lấy 50 ml mẫu nước đã được lọc qua giấy lọc
Thêm vào 2 ml DEG Thêm 5 ml Acetonitril Thêm 5 ml chloroform
Lắc đều để yên tách lớp
Lấy lớp dưới cho vào bình cầu 100 ml
Thêm tiếp vào bình (250 ml)
5 ml Acetonitril và 5 ml chloroform Lắc điều để yên tách lớp
Lấy lớp dưới cho vào bình cầu 100 ml ban đầu
Cơ quay chân khơng ở 45oC Hồn nguyên bằng 1 ml n-hexan
Lọc
Hút 1 µl phân tích GC-ECD Vortex
250 ml
Chuẩn bị mẫu phân tích: hút 20 ml mẫu nước đã được lọc qua giấy
lọc cho vào ống falcon 15 ml. Tiến hành ly trích Dichlorvos.
Chuẩn bị mẫu kiểm sốt có thêm chuẩn: hút 20 ml mẫu nước đã
được lọc qua giấy lọc cho vào ống falcon 15 ml. Thêm 50 l dung dịch chuẩn
Dichlorvos 1 ppm. Tiến hành ly trích Dichlorvos.
Ly trích Dichlorvos
- Hút chính xác 20 ml mẫu nước đã được lọc qua giấy lọc cho qua cột
SPE.
Trước khi cho mẫu nước qua cột SPE, cột SPE được hoạt hóa bằng 2 ml MeOH và 2 ml nước cất.
Sao khi cho mẫu nước qua cột SPE cho tiếp 2 ml nước cất.
Cuối cùng cho qua Cột SPE 7 ml Ethyl acetate để rửa giải chất phân tích, dịch trích cho vào bình cầu 100 ml
-Sau đó đem cơ quay đến khơ.
- Hoàn nguyên bằng 1 ml n-hexan. Chú ý lắc đều bình cầu quả lê để hịa tan hết cặn trong bình.
- Lọc dịch thu được qua lọc 0,2 m vào vial GC và đem phân tích.
Tóm tắt q trình ly trích Dichlorvos
Hút 20 ml nước
Qua cột SPE (C18)
(trước đó, cột SPE được hoạt hóa bằng 2 ml MeOH và 2 ml H2O)
Cho qua cột SPE 2 ml H2O
Rửa giải Dichlovos từ SPE bằng 7 ml Ethyl acetate
Cơ quay chân khơng ở 45oC
Hồn ngun bằng 1 ml n-hexan Lọc qua đầu col 0.2 µm
3.2.4 Thí nghiệm 4: Xây dựng phương trình đường chuẩn Dichlorvos cho mẫu cá và mẫu nước mẫu cá và mẫu nước
3.2.4.1 Mục đích: Dựa vào phương trình đường chuẩn xác định nồng độ
Dichlorvos cho từng thời gian thu mẫu cá và mẫu nước.
3.2.4.2 Phương pháp: a. Mẫu cá:
Sử dụng quy trình trên chiết tách mẫu cá Spike 20µl, 40µl, 50µl, 70µl, 100µl Dichlorvos chuẩn nồng độ 1 ppm.
Sử dụng phần mềm Excel tiến hành vẽ đồ thị.
b. Mẫu nước:
Sử dụng quy trình trên chiết tách mẫu nước Spike 20 µl, 50 µl, 70 µl, 100 µl, 120 µl, 150 µl Dichlorvos chuẩn nồng độ 1 ppm.
Sử dụng phần mềm Excel tiến hành vẽ đồ thị. 3 g mẫu cá
Sử dụng quy trình chiết tách 1 cho mẫu cá Tiến hành ly trích
Xay nhỏ
Spike 10 µl Dichlorvos chuẩn nồng độ 1 ppm vào mẫu cá Vortex
50 ml nước
Sử dụng quy trình chiết tách 1 cho mẫu nước Tiến hành ly trích mẫu
Lọc sạch
Spike 10 µl Dichlorvos chuẩn nồng độ 1 ppm vào mẫu nước Lắc đều
3.2.5 Thí nghiệm 5: Thí nghiệm xác định thời gian tồn lưu của Dichlorvos trong cá tra và mẫu nước. trong cá tra và mẫu nước.
3.2.5.1 Đối tượng nghiên cứu:
Chuẩn bị cá: Cá thí nghiệm được mua từ trại giống ở Cần Thơ, có khối
lượng từ 15- 20 g/con. Chọn cá khỏe như có màu sắc tươi sáng tự nhiên, đồng
cỡ, hoạt động khỏe mạnh, khơng bị dị tật và khơng có dấu hiệu bệnh tật. Thức ăn sử dụng trong thí nghiệm viên dạng nổi có hàm lượng đạm 30 %, mỗi ngày cho cá ăn 2 lần (lúc 8 giờ và 16 giờ), khẩu phần ăn từ 5-6 % khối
lượng thân. Hệ thống thí nghiệm được thiết kế có sục khí liên tục, có thể cho nước chảy liên tục.
Thuần dưỡng cá 1 tuần.
3.2.5.2 Phương pháp gây nhiễm Dichlorvos
Cá được gây nhiễm Dichlorvos 2 lần trong q trình thí nghiệm.
Gây nhiễm lần 1: giảm mức nước trong bể xuống 30 % và cho Dichlorvos vào bể đạt các nồng độ qui định, sau 6 giờ thì nâng mức nước lên
đầy bể. Sau 3 ngày thay hết nước trong bể và bắt đầu gây nhiễm lần 2.
Gây nhiễm lần 2: sau khi gây nhiễm lần 1 và thu mẫu ở thời điểm trước
khi thay nước thì tiến hành giảm 30 % mực nước và gây nhiễm Dichlorvos lần
2 và sau 6 giờ ta tiến hành nâng nước lên đầy bể. Thí nghiệm gồm 2 nghiệm thức:
Nghiệm thức 1: nồng độ Dichlorvos 0,25 mg/L Nghiệm thức 2: nồng độ Dichlorvos 0,5 mg/L.
Mật độ bố trí cá là 50 con/bể và cá được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên Mỗi nghiệm thức bố trí 3 bể, mỗi bể có thể tích là 500L. Hệ thống bể
3.2.5.3 Bố trí thí nghiệm
Thu mẫu các yếu tố môi trường: nhiệt độ, oxy, pH được đo mỗi ngày 2 lần trong suốt 7 ngày gây nhiễm Dichlorvos và định kỳ vào các ngày thu mẫu cá phân tích tồn lưu kháng sinh.
Thu mẫu cá và nước để phân tích thời gian tồn lưu Dichlorvos. Thu mẫu cá và nước tại thời điểm trước khi gây nhiễm Dichlorvos.
Nước chỉ được gây nhiễm Dichlorvos trong vòng 7 ngày và chuyển
sang môi trường nước sạch để nuôi và tiến hành thu mẫu.
Thu mẫu cá (5con/lần/bể) và nước (200ml/lần/bể) vào các khoảng thời gian sau:
Hình 3.9 Tiến trình thu mẫu cá thí nghiệm
3.2.5.4 Tiến hành thí nghiệm
Thu mẫu cá ban đầu trước khi gây nhiễm Dichlorvos. Cho cá thí nghiệm ăn thức ăn và gây nhiễm Dichlorvos 2 lần, sau mỗi lần gây nhiễm tiến hành thu mẫu ở các mức thời gian.
Thu mẫu ứng với thời gian T0: trước khi nhiễm Dichlorvos.
Thu mẫu ứng với thời gian T1: sau khi nhiễm Dichlorvos (lần 1) 6 giờ. Thu mẫu ứng với thời gian T2: sau khi nhiễm Dichlorvos (lần 1) 72 giờ. Thu mẫu ứng với thời gian T3: sau khi nhiễm Dichlorvos (lần 2) 6 giờ. Thu mẫu ứng với thời gian T4: sau khi nhiễm Dichlorvos (lần 2) 72 giờ. Thu mẫu ứng với thời gian T5: sau khi nhiễm Dichlorvos (lần 2) 7 ngày. Thu mẫu ứng với thời gian T6: sau khi nhiễm Dichlorvos (lần 2) 15 ngày Thu mẫu ứng với thời gian T7: sau khi nhiễm Dichlorvos (lần 2) 30 ngày Thu mẫu ứng với thời gian T8: sau khi nhiễm Dichlorvos (lần 2) 60 ngày
Sau khi gây nhiễm lần 2 72 giờ tiến hành thay nước thay nước hoàn toàn. T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 Gây nhiễm lần 1 Gây nhiễm lần 2
3.2.5.5 Chuẩn bị mẫu
Cá sau khi thu mẫu được fillet, cắt nhỏ và cho vào cối xay nhuyễn, bảo quản ở nhiệt độ -20oC cho đến khi phân tích. Thu mẫu nước bảo quản ở nhiệt độ -20oC cho đến khi phân tích.
3.3 Xử lý số liệu
Chương 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Tối ưu hóa hệ thống sắc ký khí
Bảng 4.3 Diện tích peak của Dichlorvos khi chạy sắc ký khí với dung dịch chuẩn ở nồng độ 50 ppb theo các chu trình nhiệt độ.
Hình 4.10 Đồ thị diện tích peak ở các chu trình nhiệt độ khác nhau.
Kết luận: Qua hình cho thấy các chu trình nhiệt độ khác nhau sẽ cho diện tích peak khác nhau. Chu trình 2 cho diện tích peak lớn nhất nhưng do độ trơi nên q lớn khó nhận ra được peak, chu trình 1 cho diện tích peak khơng bằng chu trình 2 nhưng do độ trơi nền thấp nên khả năng thấy peak cao hơn, ba chu trình
Diện tích peak Chu trình nhiệt độ (CT) Nồng độ dung dịch chuẩn 4 chất (ppb) Dichorvos CT1 50 10.74 CT2 50 11.53 CT3 50 12.23 CT4 50 14.23 CT5 50 14.24 dichlorvos 50 ppb 0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 160000 CT1 CT2 CT3 CT4 CT5
cịn lại diện tích peak khơng lớn. Kết quả chọn chu trình 2 cho chạy sắc ký khí trong phân tích Dichlorvos.
4.2 Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi khi làm khô dung dịch chiết tách bằng hệ thống cơ quay và thổi khí Nitơ bằng hệ thống cơ quay và thổi khí Nitơ
Cách tính hiệu suất thu hồi
Bảng 4.4 Hiệu suất thu hồi giữa 2 hệ thống làm khô dung dịch chuẩn.
Hình 4.11 Đồ thị thể hiện hiệu suất thu hồi giữa thổi khơ khí nitơ và cơ quay. Kết quả hình 4.11 cho thấy hiệu suất thu hồi của hệ thống thổi khí nitơ cao
hơn so với hệ thống cơ quay. Nhưng do trong q trình làm thí nghiệm bình khí khơng đảm bảo đủ để làm thí nghiệm liên tục nên khơng thể dùng hệ thống
thổi khơ bằng khí nitơ mà phải dùng hệ thống cô quay để làm khô mẫu. Kết quả Chất phân tích Nồng độ
(50 ppb) Thổi khơ Cô quay Spike chuẩn trước 70957 50092
Spike chuẩn sau 121723 169442 Dichlorvos
Hiệu suất thu hồi 58% 30% Diện tích peak spike chuẩn trước
Diện tích peak spike chuẩn sau
% = * 100% dichlorvos 0 10 20 30 40 50 60 70
cô quay thổi khô
h iệ u s u ấ t (% )
4.3 Khảo sát các quy trình chiết tách Dichlorvos trong cá tra và trong nước bằng sắc kí khí ghép với đầu dị bắt giữ điện tử (GC-ECD). 4.3.1 Trên mẫu cá:
Kết quả phân tích Hiệu suất thu hồi (%) Thêm chuẩn trước 62250
Quy trình chiết tách 1
ACN Thêm chuẩn sau 75454 82,5 Thêm chuẩn trước 29683
Quy trình chiết tách 2
ACN:Acetone (1:1) Thêm chuẩn sau 63349 46,9 Thêm chuẩn trước 29811
Quy trình chiết tách 3
Ethyl acetate Thêm chuẩn sau 36512 81,6
Bảng 4.5 Hiệu suất thu hồi của 3 quy trình chiết tách mẫu cá.
Hình 4.12 đồ thị thể hiện hiệu suất thu hồi của 3 quy trình chiết tách mẫu cá.
Kết quả từ hình 4.2 cho thấy hiệu suất thu hồi của quy trình 1 dùng Acetonitril là cao nhất so với hai quy trình cịn lại là dùng Ethyl acetate và dung dịch Acetonitril-acetone (1:1) nên quy trình 1 được chọn làm quy trình phân tích Dichlorvos trên mẫu cá.
82.5 46.9 81.6 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 QT1 QT2 QT3 h iệ u s u ấ t (% )
4.3.2 Trên mẫu nước
Số lần lặp lại Kết quả phân tích (Area) Hiệu suất thu hồi TB (%)
Thêm chuẩn trước (150 ppb)
1 110040
2 75900
TB 92970
68,3 Thêm chuẩn sau (150 ppb)
Quy trình chiết tách 1
136200
Thêm chuẩn trước (150 ppb)
1 49600
2 48500
TB 49050
38,8 Thêm chuẩn sau (150 ppb)
Quy trình chiết tách 2
126500
Thêm chuẩn trước (150 ppb)
1 KPH
2 KPH
TB 0
0,0 Thêm chuẩn sau (150 ppb)
Quy trình chiết tách 3
128200
Bảng 4.6 hiệu suất thu hồi của 3 quy trình chiết tách mẫu nước.
Hình 4.13 đồ thị thể hiện hiệu suất thu hồi của 3 quy trình chiết tách mẫu nước Kết quả từ hình 4.13 cho thấy hiệu suất thu hồi của quy trình 1 dùng
MẪU NƯỚC 0 10 20 30 40 50 60 70 80 QT1 QT2 QT3 h iệ u s u ấ t (% )
Ethyl acetate rửa giải qua cột SPE nên quy trình 1 được chọn làm quy trình
phân tích Dichlorvos trên mẫu cá.
4.4 Xây dựng phương trình đường chuẩn 4.4.1 Mẫu cá 4.4.1 Mẫu cá
Hình 4.14: Đồ thị đường chuẩn cho mẫu cá Diện tích peak đo được Diện tích peak đo được Nồng độ dãy chuẩn (ppb) dichlorvos 10 28600 20 39700 40 46300 50 59700 70 67800 100 76200 y = 528.6x + 27501 R2 = 0.9462 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 10 0 11 0 nồng độ (ppb) tí n h h iệ u p e a k Series1 Linear (Series1)
4.4.2 Mẫu nước
Nồng độ dichlorvos
chuẩn (ppb) Diện tích peak đo được
20 37600 50 68500 70 94700 100 100300 120 111000 150 136200
Hình 4.15: Đồ thị đường chuẩn cho mẫu nước
y = 703.13x + 31617 R2 = 0.951 0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 160000 0 50 100 150 200 nồng độ (ppb) d iệ n t íc h p e a k
4.5 Thí nghiệm xác định thời gian tồn lưu của Dichlorvos trong cá tra và mẫu nước. mẫu nước.
Hình 4.16 đồ thị thể hiện sự tồn lưu của Dichlorvos trên mẫu cá theo thời gian thí nghiệm
Kết quả phân tích cho thấy ngay sau khi kết thúc gây nhiễm Dichlorvos với nồng độ 0,25 ppm; 0,5 ppm cho thấy sự tồn lưu Dichlorvos trong mẫu cá là rất cao. Tuy nhiên, sự tồn lưu của Dichlorvos giảm dần theo thời gian và
đến ngày 30 sau khi gây nhiễm thì hàm lượng Dichlorvos còn lại trên cá
<LOD. 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 n ồ n g đ ộ ( p p b ) bể 1 (0,25 ppm) bể 2 (0,25 ppm) bể 3 (0,25 ppm) bể 1 (0,5 ppm) bể 2 (0,5 ppm) bể 3 (0,5 ppm) T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 Thời gian 0 50 100 150 200 250 300 350 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 n ồ n g đ ộ bể 1 (0,25 ppm) bể 2 (0,25 ppm) bể 3 (0,25 ppm) bể 1 (0,5 ppm) bể 2 (0,5 ppm) bể 3 (0,5 ppm) T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 Thời gian (p p b )
Hình 4.17 đồ thị thể hiện sự tồn lưu của Dichlorvos trong mẫu nước theo thời gian thí nghiệm
Hình 17 cho thấy ngay sau khi kết thúc gây nhiễm Dichlorvos với nồng
độ 0,25 ppm; 0,5 ppm cho thấy sự tồn lưu Dichlorvos trong nước là rất cao.
Tuy nhiên, sự tồn lưu của Dichlorvos giảm dần theo thời gian do quá trình
thay nước và đến ngày 30 sau khi gây nhiễm thì hàm lượng Dichlorvos còn lại trong nước <LOD.
4.6 Giới hạn định lượng LOQ
Cách quy đổi: ppb g ng g g ppm 1000 1 1000 1 1 1
Spike chuẩn trên 2g mẫu:
Dichlorvos: 10l ở nồng độ 1ppm 10ng/2g = 5ng/g
Spike chuẩn trên 50ml mẫu nước
Dichlorvos: 100l ở nồng độ 100 ppb 10ng/50ml = 0.2ng/ml
Kết luận
Bảng 4.7 Giới hạn phát hiện trên mẫu LOQ trên mẫu (ppb) LOQ trên mẫu (ppb) Mẫu
Dichlorvos
Cá 5 ppb
Nước 0,2 ppb
4.7 So sánh giới hạn phát hiện giữa các phương pháp xác định Dichlorvos
Sử dụng phương pháp HPLC phân tích trichlorfon trong nước biển ở Nauy (Samuelsen, 1987): sử dụng hệ thống HPLC SP-8700, pha động:
acetonitril – phosphate, PH 5,5 (20-80). Đầu dò cài đặt ở bước sóng 205 nm, tốc độ dịng 1 ml/phút, áp suất 2000 psi, thể tích tiêm 100 µL. Giới hạn phát hiện (LOD) củatrichlorfon là 1 ppm và dichlorvos là 0,02 ppm.
Nghiên cứu xác định trichlorfon trên bắp cải, sử dụng HPLC-UV xúc tác oxy hóa bằng benzidine: sử dụng hệ thống HPLC (Waters, Milford, MA, USA). Pha động: methanol-nước (75:25, v/v), tốc độ lưu lượng 0,8 mL/phút, đầu dị có bước sóng đặt ở 365 nm. Giới hạn phát hiện LOD là 2 µg/L (2 ppm)
methanol : nước, tốc độ dòng 1mL/phút, đầu dò đặt ở 190-370 nm, LOD là
0,01µg/g (0,01 ppm)
Xác định dư lượng Trichlorfon ở tơm bằng phương pháp sắc ký khí sử
dụng đầu dò nito-phospho, sử dụng hệ thống GC-5890 kết hợp đầu dị NPD, sử dụng ethyl acetate để ly trích mẫu, làm sạch bằng cột SPE, gadient nhiệt độ: 80oC tăng lên 130oC tốc độ 5oC/phút giữ 1 phút, sao đó tăng lên 190oC tốc độ 5oC/phút, tiếp tục tăng đến 230oC tốc độ 20oC/phút và giữ ổn dịnh 4 phút, LOD cho trichlorfon 8 ppb, LOQ cho Dichlorvos là 14 ppb.
Phương pháp xác định Dichlorvos sử dụng hệ thống GC-2010, dung
môi chiết tách Acetonitril, gadient nhiệt độ: 100oC giữ ổn định 6 phút sau đó
tăng lên 230oC tốc độ 20oC/phút giữ ổn định 3 phút tiếp tục tăng lên 260oC tốc
độ 10oC/phút giữu ổn định 1 phút, giới hạn phát hiện (LOD) là 10 ppb.
Kết quả cho thấy giới hạn phát hiện của GC-2010 sử dụng đầu dò ECD cho kết quả tối ưu hơn so với 4 phương pháp cịn lại.
4.8 Yếu tố mơi trường 4.8.1 Ơxy 4.8.1 Ôxy
Bảng 4.8 lượng oxy trong nước trong 7 ngày đàu và các ngày thu mẫu.
ngày Bể 1 (0,25 ppm) Bể 2 (0,25 ppm) Bể 3 (0,25 ppm) Bể 1 (0,5 ppm) Bể 2 (0,5 ppm) Bể 3 (0,5 ppm) Sáng 6,3 6,5 6,6 5,8 6,2 6,8