Đánh giá sự biến đổi một số chỉ tiêu vi sinh của sữa tươi tiệt trùng Vinamilk và Vixumilk (có cùng ngày sản xuất với mỗi loại) theo thời gian.
Hình 3.1: Bố trí thí nghiệm
- Sự biến đổi một số chỉ tiêu vi sinh của sữa tươi tiệt trùng Vinamilk và Vixumilk được đánh giá thông qua phân tích 10 bịch sữa cùng ngày sản xuất (đối với mỗi loại) theo thời gian, thời gian phân tích mỗi bịch cách nhau 6 ngày.
- Đánh giá cảm quan các chỉ tiêu: Tồn trữ
- Đánh giá cảm quan
- Phân tích một số chỉ tiêu vi sinh
Kết quả phân tích Sữa tươi tiệt trùng
+ Hình dạng bịch sữa + Trạng thái sữa + Màu sắc + Mùi + Vị
- Phân tích một số chỉ tiêu vi sinh: + Tổng vi sinh hiếu khí
+ Định lượng Coliforms
+ Định lượng E.coli
- Thí nghiệm được lặp lại 2 lần với mỗi loại sữa. - Mẫu phân tích được chọn ngẫu nhiên.
3.4 Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Định lượng tổng vi sinh hiếu khí (TPC) trong sữa tươi tiệt trùng bằng phương pháp đổ đĩa
Việc đếm tổng số vi sinh cung cấp một phương tiện tiêu chuẩn để xác định mật độ vi khuẩn tổng quát trong mẫu. Để xác định số lượng vi sinh vật trong một đơn vị khối lượng mẫu cần chuyển một thể tích mẫu xác định vào trong môi trường nuôi cấy. Mỗi khuẩn lạc được hình thành trên môi trường sau khi ủ được xem như là hình thành từ một tế bào riêng lẻ.
3.4.1.1 Nguyên tắc
Tổng vi sinh hiếu khí được đếm bằng cách đổ đĩa và ủ trong điều kiện hiếu khí ở 300C trong 72h ± 6h.
3.4.1.2 Quy trình phân tích
a. Đổ đĩa
Hút mẫu vào 2 đĩa petri trống vô trùng (mỗi đĩa 1ml). Đổ vào mỗi đĩa đã cấy mẫu 10 - 15 ml môi trường PCA (được đun chảy và để nguội đến khoảng 450C). Lắc đều để mẫu khuyếch tán vào môi trường, để môi trường đông đặc.
b. Nuôi ủ
c. Đọc kết quả
Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa, chọn các đĩa có số khuẩn lạc nhỏ hơn 250 để tính.
d. Tính toán
Tổng vi sinh hiếu khí (TPC)
Trong đó:
+ N : Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa + n1 : Số đĩa ở độ pha loãng f1
+ ni : Số đĩa ở độ pha loãng fi
+ V1 : Thể tích mẫu cấy ở độ pha loãng f1 + Vi : Thể tích mẫu cấy ở độ pha loãng fi + fi : Độ pha loãng.
3.4.2 Định lượng Coliforms trong sữa tươi tiệt trùng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc khuẩn lạc
3.4.2.1 Nguyên tắc
Để định lượng Coliforms cần cấy một lượng mẫu xác định trên môi trường thạch chọn lọc, sau khi ủ ở 370C trong khoảng thởi gian 24h, đếm số lượng khuẩn lạc
Coliforms điển hình. Xác định lại bằng các phản ứng đặc trưng. Môi trường chọn lọc là môi trường chứa lactose, đây là nguồn carbon duy nhất, đồng thời trong môi trường còn chứa muối mật là tác nhân chỉ chọn lọc cho vi khuẩn gram âm. Khẳng định các vi khuẩn cho hình dạng khuẩn lạc điển hình bằng môi trường canh chọn lọc như Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL).
3.4.2.2 Quy trình phân tích
a. Phân lập
Hút mẫu vào 2 đĩa petri trống vô trùng (mỗi đĩa 1ml), đổ vào mỗi đĩa 5ml môi trường TSA lắc đều để ở nhiệt độ phòng khoảng 15 - 30 phút, đỗ tiếp vào mỗi đĩa 10 - 15ml môi trường VRB để đông đặc.
N
TPC ( CFU/ml) = --- n1.V1.f1+...+ni.Vi.fi
b. Nuôi ủ
Lật ngược đĩa và ủ ở 370C trong 24h. c. Đọc kết quả
Chọn và đếm tất cả các khuẩn lạc có màu đỏ đến đỏ sậm có quầng tủa muối mật đường kính > 0,5mm.
d. Khẳng định
Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy sang 5 ống môi trường BGBL có chứa ống durnham, ủ ở 370C trong 24h.
e. Đọc kết quả
Đếm số ống nghiệm BGBL có sinh khí (+)
f. Tính toán
- Tỷ lệ xác nhận R
Số khuẩn lạc sinh hơi trong BGBL R = --- Số khuẩn lạc đã cấy - Số lượng Coliforms Trong đó: + N: Tổng số khuẩn lạc đếm được + n : Số đĩa
+ V: Thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa + f : Độ pha loãng (f = 1).
+ R: Tỷ lệ xác nhận.
N
C ( CFU/ml) = --- . R n.V.f
3.4.3 Định lượng Escherichia coli (E.coli) trong sữa tươi tiệt trùng bằng phương pháp lên men nhiều ống MPN ( Most Probable Number) pháp lên men nhiều ống MPN ( Most Probable Number)
Đây là phương pháp dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố của vi sinh vật trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu. Mẫu được cho vào các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của từng loại vi sinh vật cần định lượng một thể tích chính xác dung dịch mẫu đã được pha loãng. Ủ ở nhiệt độ, thời gian thích hợp. Ghi nhận lại số ống cho kết quả dương tính và âm tính của từng độ pha loãng. Tra kết quả nhận được bằng bảng Mac Crady để tính mật độ vi sinh vật. Phương pháp MPN được dùng để định lượng E.coli khi chúng phát triển được trong môi trường lỏng và tạo ra các tín hiệu dễ dàng nhận dạng như: sinh hơi, làm đục môi trường chọn lọc, làm thay đổi pH của môi trường... [1]
3.4.3.1 Các hệ thống thường dùng trong phương pháp lên men nhiều ống MPN
- Hệ thống 1: Mỗi dãy 3 ống
Dãy 1 3 ống 10ml mẫu nước
Dãy 2 3 ống 1ml mẫu nước
Dãy 3 3 ống 0,1ml mẫu nước
- Hệ thống 2: Mỗi dãy 5 ống
Dãy 1 5 ống 10ml mẫu nước
Dãy 2 5 ống 1ml mẫu nước
Dãy 3 5 ống 0,1ml mẫu nước
- Hệ thống 3: (Dùng trong trường hợp nước uống)
Dãy 1 5 ống 10ml mẫu nước
Dãy 2 1 ống 1ml mẫu nước
Dãy 3 1 ống 0,1ml mẫu nước.[1]
3.4.3.2 Nguyên tắc
Số lượng E.coli có thể xác định được bằng phương pháp MPN. Phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân liên tiếp (hai nồng độ kế tiếp chênh nhau 10 lần) và đưa vào các ống nghiệm có chứa môi trường
thích hợp có chứa ống durnham, ủ và đọc số ống có kết quả dương tính. Số ống nghiệm cho phản ứng dương tính của các nồng độ pha loãng được tra theo bảng MPN để xác định số lượng E.coli /100ml.
3.4.3.3 Quy trình phân tích
a. Cấy mẫu
Xếp 9 ống nghiệm môi trường Lastose broth có chứa ống durnham lên giá ống nghiệm làm 3 dãy (hệ thống 1, mỗi dãy 3 ống nghiệm):
- Lấy 10ml mẫu cho vào 3 ống dãy 1 - Lấy 1ml mẫu cho vào 3 ống dãy 2 - Lấy 0,1ml mẫu cho vào 3 ống dãy 3
Lắc nhẹ để mẫu trộn đều vào môi trường, tránh tạo bọt khí, ủ ở 440C trong 24h. b. Tăng sinh
Chọn các ống nghiệm sinh khí (+) cấy chuyển sang môi trường canh EC có chứa ống durnham (cấy chuyển theo 3 dãy tương ứng), ủ ở 440C trong 24h.
c. Phân lập
Chọn các ống nghiệm có sinh khí (+) cấy chuyển sang môi trường EMB, ủ ở 370C trong 24h (cấy chuyển theo 3 dãy tương ứng)
d. Khẳng định
Chọn các khuẩn lạc tròn, dẹt, có hình đĩa và có ánh kim tím cấy chuyển sang môi trường thử nghiệm pháp IMViC, ủ ở 370C trong 24h
e. Đọc kết quả
Đọc kết quả những ống nghiệm cho nghiệm pháp IMViC (+)(+)(-)(-). Tra bảng MPN để xác định số lượng E. Coli được biểu diễn với đơn vị MPN/100ml.
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả đánh giá cảm quan
4.1.1 Hình dạng bịch sữa
4.1.1.1 Đối với sữa tươi tiệt trùng Vinamilk
Hình 4.1: Bịch sữa tươi tiệt trùng Vinamilk bị phình to (trái) và bịch sữa tươi tiệt trùng Vinamilk hình dạng bình thường (phải).
- Tuần phân tích 14 – 22: tất cả các bịch sữa đều có hình dạng bình thường - Tuần phân tích 23: cả 2 bịch sữa tươi đều phình to, có 1 bịch chảy sữa ra ngoài.
Hình 4.2: Bịch sữa tươi tiệt trùng Vixumilk bị phình to (trái) và bịch sữa tươi tiệt trùng Vixumilk hình dạng bình thường (phải).
Hình 4.3: Bịch sữa tươi tiệt trùng Vixumilk bị phình to và hở mối hàn.
- Tuần phân tích 14 – 22: tất cả các bịch sữa đều có hình dạng bình thường.
- Tuần phân tích 23: 1 bịch sữa có hình dạng bình thường, 1 bịch phình to và bị hở mối hàn.
Tất cả các bịch sữa tươi tiệt trùng của cả Vinamilk và Vixumilk phân tích ở tuần 14 – 22 sau ngày sản xuất đều có hình dạng bình thường, ở tuần phân tích 23, 2 bịch sữa của Vinamilk đều phình to, 1 bịch của Vixumilk phình to và bị hở mối hàn.
Những biểu hiện trên của các bịch sữa của cả 2 hãng cho thấy sữa không thể tiếp tục được sử dụng trong khi còn hạn. Các bịch sữa bị phình to có thể là do theo
thời gian bảo quản trong sữa có một số chất khí như NH3, H2S, CO2, H2…được hình thành ngày một nhiều làm cho các bịch sữa bị phình to, rách mối hàn.
4.1.2 Trạng thái sữa
4.1.2.1 Đối với sữa tươi tiệt trùng Vinamilk
- Tuần phân tích 14 – 19: tất cả các mẫu sữa đều ở trạng thái lỏng đồng nhất. - Tuần phân tích 20 và 21:
+ Mẫu Vinamilk 20.1 và 21.1 có sữa ở trạng thái lỏng đồng nhất.
+ Mẫu Vinamilk 20.2 và 21.2 có sữa ở trạng thái lỏng nhưng không đồng nhất, lợn bợn, vón cục.
- Tuần phân tích 22: tất cả các mẫu sữa đều ở trạng thái lỏng nhưng không đồng nhất, lợn bợn, vón cục.
- Tuần phân tích 23: tất cả các mẫu sữa đều ở trạng thái hơi sệt sệt, vón cục.
Hình 4.4: Mẫu sữa tươi tiệt trùng Vinamilk bị lợn bợn, vón cục (trái) và mẫu sữa tươi tiệt trùng Vixumilk có trạng thái bình thường (phải).
Hình 4.5: Mẫu sữa tươi tiệt trùng Vixumilk bị lợn bợn, vón cục (trái) và mẫu sữa tươi tiệt trùng Vixumilk có trạng thái bình thường (phải).
- Tuần phân tích 14 – 20: tất cả các mẫu sữa đều ở trạng thái lỏng đồng nhất. - Tuần phân tích 21:
+ Mẫu Vixumilk 21.1 có sữa ở trạng thái lỏng đồng nhất.
+ Mẫu Vixumilk 21.2 có sữa ở trạng thái lỏng nhưng không đồng nhất, lợn bợn, vón cục.
- Tuần phân tích 22: tất cả các mẫu sữa đều ở trạng thái lỏng nhưng không đồng nhất, lợn bợn, vón cục.
- Tuần phân tích 23:
+ Mẫu Vixumilk 23.1 có sữa ở trạng thái lỏng nhưng không đồng nhất, lợn bợn, vón cục.
+ Mẫu Vixumilk 23.2 có sữa ở trạng thái hơi sệt sệt, vón cục.
Từ tuần phân tích 14 – 19 tất cả các mẫu sữa của cả Vinamilk và Vixumilk đều có trạng thái lỏng đồng nhất. Riêng đối với sữa tươi tiệt trùng Vinamilk các mẫu sữa phân tích từ tuần 20 – 23 bắt đầu xuất hiện những dấu hiệu: sữa ở trạng thái lỏng không đồng nhất, lợn bợn rồi hơi sệt sệt, vón cục. Đối với sữa tươi tiệt trùng Vixumilk có sự biểu hiện chất lượng sữa không tốt sau sữa tươi tiệt trùng Vinamilk, ở tuần phân tích thứ 20 các mẫu phân tích đều có trạng thái sữa bình thường, từ tuần phân tích 21 – 23 các mẫu sữa phân tích đều có dấu hiệu cho thấy sữa bị hỏng với mức độ tăng dần.
Nhìn chung chất lượng sữa của cả 2 hãng đều giảm dần theo thời gian bảo quản, qua kết quả đánh giá cảm quan về trạng thái sữa cho thấy các mẫu sữa không thể tiếp tục được sử dụng trong khi còn hơn một tháng nữa mới hết hạn. Các mẫu sữa có trạng thái lỏng không đồng nhất đến lợn bợn rồi hơi sệt sệt, vón cục có thể là do pH giảm dần theo thời gian bảo quản làm casein trong sữa kết tủa.
4.1.3.1 Đối với sữa tươi tiệt trùng Vinamilk
- Tuần phân tích 14 – 23: tất cả các mẫu sữa đều có màu trắng ngà.
4.1.3.2 Đối với sữa tươi tiệt trùng Vixumilk
- Tuần phân tích 14 – 23: tất cả các mẫu sữa đều có màu hồng nhạt.
Tất cả các mẫu sữa được phân tích của cả Vinamilk và Vixumilk hầu như có màu sắc không thay đổi theo thời gian bảo quản, có thể màu sắc của các mẫu phân tích của cả 2 hãng có thay đổi theo thời gian bảo quản nhưng ít, không thể nhận thấy khi quan sát bằng mắt thường.
4.1.4 Mùi
4.1.4.1 Đối với sữa tươi tiệt trùng Vinamilk
- Tuần phân tích 14 – 19: tất cả các mẫu sữa đều có mùi thơm đặc trưng của sữa tươi. - Tuần phân tích 20 và 21:
+ Mẫu Vinamilk 20.1 và 21.1 có mùi thơm đặc trưng của sữa tươi.
+ Mẫu Vinamilk 20.2 và 21.2 có mùi sữa đồng thời có mùi hơi chua chua. - Tuần phân tích 22: các mẫu có mùi sữa đồng thời có mùi hơi chua chua. - Tuần phân tích 23: các mẫu có mùi chua nồng, hơi tanh.
4.1.4.2 Đối với sữa tươi tiệt trùng Vixumilk
- Tuần phân tích 14 – 20: tất cả các mẫu sữa đều có mùi hương dâu. - Tuần phân tích 21:
+ Mẫu Vixumilk 21.1 có mùi hương dâu.
+ Mẫu Vixumilk 21.2 có mùi sữa đồng thời có mùi hơi chua chua. - Tuần phân tích 22: có mùi sữa đồng thời có mùi hơi chua chua. - Tuần phân tích 23:
+ Mẫu Vixumilk 23.1 có mùi sữa đồng thời có mùi hơi chua chua. + Mẫu Vixumilk 23.2 có mùi chua nồng, hơi tanh.
Từ tuần phân tích 14 – 19 tất cả các mẫu sữa của cả Vinamilk và Vixumilk đều có mùi đặc trưng của từng loại sữa. Riêng đối với sữa tươi tiệt trùng Vinamilk từ tuần 20 – 23 bắt đầu xuất hiện những dấu hiệu: sữa có mùi hơi chua chua đến chua nồng, hơi tanh. Đối với sữa tươi tiệt trùng Vixumilk có biểu hiện mùi sữa không tốt sau sữa tươi tiệt trùng Vinamilk, ở tuần phân tích thứ 19 và 20 các mẫu phân tích đều
có mùi bình thường, từ tuần phân tích 21 – 23 các mẫu sữa phân tích đều có dấu hiệu cho thấy sữa bị hỏng với mức độ tăng dần.
Kết quả đánh giá cảm quan về mùi sữa cho thấy chất lượng mùi sữa của cả 2 hãng đều giảm dần theo thời gian bảo quản và có những biểu hiện cho thấy sữa bị hư hỏng nặng trong khi hạn sử dụng còn hơn một tháng. Các mẫu sữa có mùi chua và tanh có thể là do pH môi trường có tính acid, protein trong sữa bị phân giải tạo ra các sản phẩm khí làm cho sữa có mùi khó chịu như: NH3, H2S...
4.1.5 Vị
4.1.5.1 Đối với sữa tươi tiệt trùng Vinamilk
- Tuần phân tích 14 – 19: tất cả các mẫu sữa đều có vị ngọt, béo. - Tuần phân tích 20 và 21:
+ Mẫu Vinamilk 20.1 và 21.1 có vị ngọt, béo.
+ Mẫu Vinamilk 20.2 và 21.2 có vị ngọt ngọt, béo, chua chua. - Tuần phân tích 22: các mẫu có vị ngọt ngọt, béo, chua chua. - Tuần phân tích 23: các mẫu có vị chua.
4.1.5.2 Đối với sữa tươi tiệt trùng Vixumilk
- Tuần phân tích 14 – 20 : tất cả các mẫu có vị ngọt, béo. - Tuần phân tích 21:
+ Mẫu Vixumilk 21.1 có vị ngọt, béo.
+ Mẫu Vixumilk 21.2 có vị ngọt ngọt, béo, chua chua. - Tuần phân tích 22: có vị ngọt ngọt, béo, chua chua. - Tuần phân tích 23:
+ Mẫu Vixumilk 23.1 có vị ngọt ngọt, béo, chua chua. + Mẫu Vixumilk 23.2 có vị chua.
Từ tuần phân tích 14 – 19 tất cả các mẫu sữa của cả Vinamilk và Vixumilk đều có vị ngọt và béo đặc trưng. Riêng đối với sữa tươi tiệt trùng Vinamilk các mẫu phân tích tuần 20 – 23 bắt đầu xuất hiện những dấu hiệu: sữa có mùi hơi chua chua rồi đến chua nồng và có mùi tanh. Đối với sữa tươi tiệt trùng Vixumilk có biểu hiện