Hình 2.10. Ảnh hưởng của chitosan và các tá chất khác đến đáp ứng miễn dịch của chuột với vaccin H5N1(a) và hiệu giá kháng thể (HIU) (b).
Nhĩm 1: Đối chứng (kháng nguyên cúm A H5N1) Nhĩm 2: Hydroxyt nhơm + kháng nguyên cúm A H5N1.
Nhĩm 3: Chitosan oligomer (1mg/ml) + kháng nguyên cúm A H5N1. Nhĩm 4: Chitosan oligomer (2mg/ml) + kháng nguyên cúm A H5N1.
Nhĩm 5: Freund + kháng nguyên cúm A H5N1 [23].
2.3. Tổng quan về Escherichia coli và Staphylococcus aureus
2.3.1 Vi khuẩn Escherichia coli
2.3.1.1. Giới thiệu chung
Trực khuẩn ruột già Escherichia coli cịn cĩ tên là Bacterium colicommure,
Bacillus colicommunis được phân lập vào năm 1885 bởi Eschirich từ phân
của những trẻ em bị viêm đường ruột, sống bình thường trong ruột người và lồi vật, nhiều nhất ở ruột già (vùng hồi manh tràng). Người ta nhận thấy rằng
Escherichia coli phát tán rất rộng lớn ở trong ruột của trẻ em, người lớn và
những động vật cĩ vú khác. Vi khuẩn thường theo phân ra ngồi thiên nhiên, do đĩ ta thường thấy trong nước, đất, khơng khí. Vi khuẩn Escherichia coli
thường sống hội sinh với nhau, là những sinh vật cĩ khả năng tiềm tàng gây ra các bệnh về đường ruột. Sự phân biệt giữa các độc tố của vi rút và các độc tố vi khuẩn Escherichia coli được xác định bằng cách sử dụng phương pháp phân loại huyết thanh. Phương pháp này lần đầu tiên được ứng dụng để nghiên cứu về dịch bệnh đường ruột ở trẻ em và sau đĩ được Kaufmann phát triển thành một hệ thống huyết thanh là nền tảng cho việc nghiên cứu ngày nay. Trong cuối những năm 1940, nhiều giống vi khuẩn Escherichia coli liên quan đến bệnh tiêu chảy đã được nhận biết dựa trên cơ sở kháng nguyên O
soma của chúng, và sự phân chia các giống thành những lồi vi khuẩn cĩ khả năng gây bệnh và sống hội sinh được hình thành .
Vai trị của vi khuẩn Escherichia coli nguyên nhân gây ra bệnh tiêu chảy ngày càng được thừa nhận trên 25 năm qua. Những sự ảnh hưởng của thú y này được mơ tả một cách tồn diện gần đây. Sự vận chuyển của vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh tiêu chảy qua đường động vật được xem là chủ yếu. Nĩ là mối đe doạ đến sức khoẻ của con người do sự nhiễm bẩn của thực phẩm hoặc là bằng cách tiếp xúc trực tiếp. Ngồi những bệnh về tiêu chảy, các chủng vi khuẩn Escherichia coli cịn thường gây ra các bệnh lây nhiễm qua đường nước tiểu và các bệnh về ruột thừa.
2.3.1.2. Đặc điểm vi sinh học
Năm 1885 Escherich phát hiện ra giống Esherichia. Theo phân loại của Eving năm 1986, giống này thuộc bộ Escherichiae, họ Enterobacteriaceae, lồi điển hình là Escherichia coli. Giống Escherichia là một phần của bộ
Escherichiae,thuộc gia đình vi khuẩn Entero – bacteriaceae và bao gồm cĩ 5
lồi. Các lồi gồm là E.hermanii, E.fergusonii và E.vulneris tất cả những lồi này được tách ra từ các nguồn gốc khác nhau của cơ thể bao gồm cả ruột và ruột thừa, lồi E.blattae là lồi chỉ được tách ra từ con gián. E.coli là lồi lớn nhất của giống này.
2.3.1.2.1.Hình thái
Vi khuẩn Escherichia coli là trực khuẩn Gram âm, hình que. Kích thước dài hay ngắn tùy thuộc mơi trường nuơi cấy, thường vào khoảng 1 ÷ 1,5 ìm × 2 ÷6 ìm. Một số vi khuẩn di động được nhờ tiên mao (lơng roi ), một số lại bất động, một số cĩ nang. Vi khuẩn khơng sinh bào tử.
2.3.1.2.2. Điều kiện nuơi cấy
Vi khuẩn Escherichia coli thuộc loại kị khí khơng bắt buộc. Nhiệt độ thích hợp nhất để phát triển là 37oC. Tuy nhiên cĩ thể tăng trưởng từ 15
÷40oC . Cĩ nhiều nhĩm vi khuẩn Escherichia coli cĩ thể chịu được ở nhiệt độ cao 55oC khoảng 60 phút và thậm chí đến 60oC khoảng 15 phút. pH phát triển tối ưu của E.coli là 4,4.
Trong mơi trường lỏng, sau 4-5h Escherichia coli làm đục nhẹ mơi trường, càng để lâu đục càng nhiều và sau vài ngày cĩ thể cĩ váng mỏng trên bề mặt mơi trường. Để lâu vi khuẩn lắng xuống đáy. Trên mơi trường thạch thường sau 18-24h tạo khuẩn lạc trơn, bờ đều, bĩng, khơng màu hay màu xám nhẹ, đường kính 2-3 mm. Trên mơi trường phân lập, vi khuẩn thường làm thay đổi màu của mơi trường vì lên men đường lactose. Khuẩn lạc cĩ màu vàng trên mơi trường Istrati và màu đỏ trên mơi trường SS.
2.3.1.2.3. Đặc điểm trao đổi chất
Escherichia coli sống ở ruột già của người và của động vật, theo phân
người và gia súc ra thiên nhiên.
E.coli lên men được nhiều loại đường glucose, lactose, sinh ra sản
phẩm của acid và hơi (ngoại trừ một số chủng EIEC khơng lên men đường lactose và khơng sinh hơi), cĩ khả năng khử nitrate thành nitrite.
E.coli cĩ enzyme trytophanase. Nếu trong mơi trường cĩ trytophan, chúng sẽ phân giải trytophan thành indol.
Một số hố chất ngăn chặn được sự phát triển của E.coli như Chlorine và các dẫn xuất, muối mật, Brillant green, Sodium deoxycholate, Sodium tetrathionate, Selenite …
2.3.1.2.4.Kháng nguyên
E.coli cĩ khoảng 150 yếu tố O, 100 yếu tố K và 50 yếu tố H. Dựa vào cơng thức kháng nguyên O, K và H người ta phân biệt E.coli được chia thành rất nhiều tuýp huyết thanh khác nhau.
Kháng nguyên O là kháng nguyên của thành tế bào. Cấu tạo bởi lipopolysaccharit. Đặc tính của kháng nguyên O là :
- Chịu được nhiệt, khơng bị huỷ khi đun nĩng 100oC trong hai giờ. - Kháng cồn, khơng bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%.
- Bị hủy bởi focmol 5%.
- Rất độc, chỉ cần 1/20mg đủ giết chết chuột sau 24 giờ.
Kháng nguyên H ( kháng nguyên tiêu hao). Chúng được cấu tạo bởi protein,cĩ các tính chất sau :
- Khơng chịu nhiệt. - Bị hủy bởi cồn 50%. - Bị hủy bởi các protease. - Khơng bị hủy bởi focmol 5%.
Kháng nguyên K ( kháng nguyên màng tế bào). Loại này chỉ cĩ ở một số vi khuẩn đường ruột. Được cấu tạo bởi polysaccharit hoặc là protein.
Căn cứ vào kháng nguyên O, K, H người ta chia Escherichia coli thành nhiều nhĩm khác nhau:
- EPEC ( Enteropathogenic E.coli ) : gây bệnh đường ruột, gây tiêu chảy ở trẻ em vào mùa hè, gây dịch ở nhà trẻ, EPEC bám dính vào bề mặt tế bào ruột, huỷ hoại tổ chức tại chổ.
- ETEC ( Enterotoxigenic E.coli ) : sinh độc tố ruột, gây tiêu chảy ở trẻ em và người du lịch, cĩ hai loại độc tố chính : khơng chịu nhiệt (LT) và chịu nhiệt (ST).
- EIEC ( Enteroinvasive E.coli ) : E.coli xâm nhập ruột, thường gây ra các vụ dịch do thực phẩm, giống như Shigella
- EHEC ( Enterohaemorrhagic E.coli ) : E.coli gây xuất huyết đường ruột, là bệnh viêm đại tràng xuất huyết lây lan qua đường ăn uống, gây hội chứng tan máu, urê huyết cao, chống (HUS), thường do E.coli O157:H7 gây ra.
- EAggEC ( Enteroaggregative E.coli ) : E.coli bám dính đường ruột giống như nhĩm EPEC.
Đây là những chủng vi khuẩn cĩ liên quan đến bệnh tiêu chảy ở người. Những vi khuẩn này thường cĩ trong những động vật dùng để sản xuất thực phẩm.
2.3.1.2.5.Khả năng gây bệnh
Khả năng gây bệnh rất đa dạng. Ở phụ nữ 90% trường hợp nhiễm khuẩn đường tiểu lần đầu là do E.coli, khi đĩ sẽ dẫn tới tiểu lắt nhắt, tiểu đau, tiểu ra máu, tiểu ra mủ. Trong trường hợp cơ thể yếu, sức đề kháng giảm E.coli sẽ vào máu gây nhiễm khuẩn máu. E.coli cĩ thể gây viêm màng não (khoảng 40% viêm màng não ở trẻ sơ sinh). Phần lớn các vụ tiêu chảy là do
E.coli gây ra. Những biểu hiện lâm sàng do nhiễm khẩn E.coli tùy thuộc vào
vị trí mà vi khuẩn xâm nhập, thường thấy nhất là :
Nhiễm khuẩn đường tiểu :
Khoảng 90% trường hợp nhiễm khuẩn đường tiểu lần đầu ở phụ nữ là do
E.coli, với các triệu chứng : tiểu lắt nhắt, tiểu đau, tiểu ra máu, tiểu ra mủ. Cĩ
thể đưa tới nhiễm khuẩn bọng đái, thận, cơ quan sinh dục và nhiễm khuẩn huyết.
Nhiễm khuẩn huyết :
Khi sức đề kháng của cơ thể giảm , vi khuẩn vào máu gây nhiễm khuẩn máu. Gặp ở trẻ sơ sinh và sau khi nhiễm khuẩn đường tiểu .
Viêm màng não
E.coli và Streptococci nhĩm B là những nguyên nhân hàng đầu gây
viêm màng não ở trẻ em . Vi khuẩn E.coli chiếm khoảng 40% trường hợp gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh, trong đĩ 75% E.coli cĩ kháng nguyên K1. Nguyên nhân tại sao độc tính của vi khuẩn lại liên hệ với kháng nguyên K1 thì chưa rõ.
Tiêu chảy
Trước đây E.coli được xem là những vi khuẩn thường trú ở trong ruột người và động vật, gây tiêu chảy nhưng ít được đề cập đến. Nhưng cùng với những tiến bộ của kỹ thuật xét nghiệm, càng ngày người ta càng phát hiện ra nhiều chủng E.coli gây tiêu chảy. Ngày nay, E.coli được xem là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tiêu chảy đặc biệt là ở trẻ em. Bệnh gặp khắp nơi trên thế giới ở các nước phát triển lẫn đang phát triển.
2.3.2. Vi khuẩn Staphylococcus aureus
2.3.2.1. Giới thiệu chung
Staphylococcus aureus là loại vi khuẩn gây bệnh thường hay gặp nhất, nĩ cĩ vai trị và ý nghĩa đối với y học, khoảng 30% người khỏe mạnh mang vi khuẩn này ở trên da và trên niêm mạc, khi cĩ những tổn thương ở da và niêm mạc hoặc những rối loạn về chức năng thí các nhiễm trùng do Staphylococcus
aureus dễ dàng xuất hiện. Staphyloccocus aureus cũng gây nên các nhiễm
trùng ở lồi gia súc nhất là trong những cơ sở chăn nuơi tập trung cĩ mật độ đàn gia súc lớn gây thiệt hại đáng kể về kinh tế. Những nhiễm trùng do
Staphylococcus aureus cĩ thể gây nên nhiều biểu hiện khác nhau, như các
nhiễm trùng của da, của các tổ chức dưới da hoặc trong các cơ quan nội tạng, gây mưng mủ điển hình, một số trường hợp chuyển sang chứng huyết nhiễm trùng, chứng bại huyết. Staphylococcus aureus cịn cĩ khả năng hình thành độc tố trong thực phẩm, do đĩ nĩ cĩ thể gây nên chứng nhiễm độc.
2.3.2.2. Đặc điểm vi sinh học 2.3.2.2.1. Đặc điểm hình thái
Staphylococcus aureus là một trong ba loại thuộc giống tụ cầu khuẩn, đường kính 0.7-1µm, khơng di động, khơng sinh nha bào và thường khơng cĩ vỏ, khơng cĩ lơng. Khi nhuộm phương pháp Gram thì vi khuẩn bắt màu Gram dương.
2.3.2.2.2. Đặc điểm nuơi cấy
Staphylococcus aureus sống hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện, nhiệt độ thích hợp 32-370C, pH thích hợp từ 5.5-7.6. Dễ mọc trên các mơi trường nuơi cấy thơng thường, sinh sắc tố trên mơi trường nuơi cấy. Chịu được nồng độ muối 12% và nồng độ đường 50%.
Mơi trường nước thịt (bổ sung NaCl 0.5%) hay mơi trường nước mắm ( độ đạm cao) và pepton : sau khi cấy 5-6h, vi khuẩn đã làm đục mơi trường, sau 24h mơi trường đục rõ ràng hơn, lắng cặn nhiều, khơng cĩ màng.
Mơi trường thạch thường : sau khi nuơi cấy khỏang 24h, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc tương đối to dạng S (Smouth), mặt khuẩn lạc hơi ướt, bờ đều nhẵn, khuẩn lạc Staphyloccocus aureus cĩ màu vàng thẫm.
Mơi trường thạch màu: vi khuẩn mọc rất mạnh sau khi cấy 24h, vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc dạng S.
2.3.2.2.3. Đặc tính sinh hĩa
Staphylococcus aureus cĩ khả năng chuyển hĩa đường glucose, lactose, saccarose, mannit, levulose và phản ứng coagulase dương tính, phản ứng catalase dương tính.
Sức đề kháng Staphylococcus aureus cĩ sức đề kháng kém đối với nhiệt độ và hĩa chất : ở 700C chết trong 1h, 800C chết trong 10-30 phút, 1000C chết trong vài phút.
Acid phenic 3-5% diệt vi khuẩn trong 3-5 phút. Focmol 1% diệt vi khuẩn trong 1h. Ở nơi khơ hanh và đĩng băng vi khuẩn cĩ sức đề kháng tốt. Ở nơi khơ ráo vi khuẩn sống được trên 200 ngày.
2.3.2.2.4.Cấu tạo kháng nguyên
Dựa vào phương pháp miễn dịch người ta phân tích được các loại kháng nguyên:
- Một kháng nguyên polysaccarid ở vách là một phức hợp mucopeptid- acid teichoic. Kháng nguyên này khi gặp kháng thể tương ứng sẽ gây nên phản ứng ngưng kết.
- Một kháng nguyên protein hay protein A là thành phần ở vách và ở phía ngồi
2.3.2.2.5.Độc tố
Độc tố dung huyết (Haemolyzin) cĩ 4 loại chính:
- Dung huyết tố anpha: gây dung giải hồng cầu thỏ ở 370C. Dung huyết tố này cũng gây hoại tử da và gây chết. Đây là một ngoại độc tố, bản chất là protein, bền với nhiệt độ. Là một kháng nguyên hồn tồn, gây hình thành kháng thể kết tủa và kháng thể trung hịa dưới tác dụng focmol và nhiệt độ nĩ biến thành giải độc tố cĩ thể là vaccine.
- Dung huyết tố beta: gây dung giải hồng cầu cừu ở 40C, dung huyết tố này kém độc hơn dung huyết tố anpha.
- Dung huyết tố denta: gây dung giải hồng cầu người, thỏ, cừu, ngựa và gây hoại tử da.
- Dung huyết tố gamma: khác với các loại trên, loại này khơng tác động lên hồng cầu ngựa.
Trong các loại dung huyết tố trên thì dung huyết tố anpha là đặc điểm cần thiết của các chủng tụ cầu cĩ khả năng gây bệnh.
Nhân tố diệt bạch cầu (Leucocidin): Dưới tác động của nhân tố này, bạch cầu mất tính di động, mất hạt và nhân bị phá hủy, nĩ giữ vai trị quan trọng trong cơ chế sinh bệnh của tụ cầu.
Độc tố ruột (Enterotoxin)
Gây bệnh đường tiêu hĩa : nhiễm độc do thức ăn, viêm ruột cấp. Độc tố ruột cĩ 4 loại : trong đĩ cĩ 2 loại đã biết.
- Độc tố ruột A : tạo ra do một chủng phân lập trong quá trình nhiễm độc thức ăn.
- Độc tố ruột B : tạo ra do một chủng phân lập trong các bệnh nhân viêm ruột.
Độc tố ruột là những ngoại độc tố, độc tố bền với nhiệt (phá hủy độc tố ở 1200C trong 20 phút), cồn, acid và khơng bị phá hủy bởi dịch vị.
2.3.2.2.6.Tính gây bệnh
Staphylococcus aureus kí sinh trên da, niêm mạc của người và gia súc. Khi
sức đề kháng của cơ thể kém, hoặc tổ chức bị tổn thương thì vi khuẩn xâm nhập và gây bệnh. Vi khuẩn cĩ thể gây những ổ mủ ở ngồi da-niêm mạc. Một số trường hợp vi khuẩn vào máu gây nhiễm khuẩn huyết, huyết nhiễm mủ. Ngồi ra, ở người cịn thấy độc tố ruột do vi khuẩn tiết ra gây nên nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp tính.
Về mức độ cảm nhiễm: ở gia súc, ngựa cảm nhiễm nhất rồi đến chĩ, bị, lợn, cừu. Gà, vịt ít cảm nhiễm, người dễ cảm nhiễm với tụ cầu.
PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Nội dung nghiên cứu
3.1.1. Nghiên cứu qui trình tạo hạt nano chitosan
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử chitosan đến kích thước hạt, điện tích và tính ổn định hạt nano chitosan bằng phương pháp tạo gel với TPP.
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ chitosan và TPP đến kích thước hạt, điện tích và tính ổn định của hạt nano chitosan
3.1.2. Nghiên cứu thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan chitosan
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ hạt nano chitosan đến khả năng kháng khuẩn.
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử hạt nano chitosan đến khả năng kháng khuẩn.
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ CS: TPP hạt nano chitosan đến khả năng kháng khuẩn.
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của pH mơi trường đến khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan.
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Hĩa chất
- Chitosan trọng lượng phân tử khác nhau: 20 kDa (DD 85%), 30 kDa (DD 85%), 300 kDa (DD 80%) sản phẩm của Keumho Chemical Products Co., Ltd, Hàn Quốc.
- TPP (Tripolyphosphate) : Na5P3O1 (M = 367,86 g/mol) K28313999122 Merck (Đức).
- Acid acetic: CH3COOH (M= 60,05 g/mol) 99,8 %, K3823463 750 Merck (Đức)
- Nước khử ion.
-Vi khuẩn Escherichia coli và vi khuẩn Staphylococcus aureus từ Viện vệ sinh dịch tể Tây Nguyên.
+ Máy mĩc và thiết bị: máy li tâm, máy khấy, kính hiển vi điện tử truyền quang (Transmission electronic microscope, TEM) JEOL, JEM 1400, Nhật Bản.
3.2.2. Địa điểm nghiên cứu
-Phịng thí nghiệm Trung tâm Cơng nghệ Sinh học, Trường Đại học Tây Nguyên, Thành phố Buơn Ma Thuột.
-Chụp ảnh TEM Tại Trường Đại học Bách Khoa, Thành phố Hồ Chí Minh
3.2.3. Thời gian thực hiện
Từ tháng 10/2009 đến tháng 6/2010.
3.2.4. Phương pháp nghiên cứu qui trình tạo hạt nano chitosan
3.2.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử chitosan đến kích thước hạt, điện tích và tính ổn định hạt nano chitosan bằng phương pháp tạo gel với TPP.
-Nội dung nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử chitosan đến kích thước hạt nano chitosan và điện thế hạt. Khối lượng phân tử chitosan là