3.2.5.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến khả năng kháng khuẩn
-Nội dung nghiên cứu nhằm tìm ra nồng độ tối ưu của chitosan trong kháng khuẩn.
- Sử dụng chitosan 300kDa cho kết quả kháng khuẩn tốt nhất (Nguyen Anh Dzung, 2003) [34] làm thí nghiệm. Chitosan hịa tan trong acid acetic để được dung dịch chitosan 0,2%.
- Đối tượng nghiên cứu là vi khuẩn E.coli và S. aureus. - Thiết kế thí nghiệm gồm 7 cơng thức:
+ Cơng thức 1: Bổ sung dung dịch chitosan vào mơi trường để cĩ nồng độ 20ppm.
+ Cơng thức 2: Bổ sung dung dịch chitosan vào mơi trường để cĩ nồng độ 40ppm.
+ Cơng thức 3: Bổ sung dung dịch chitosan vào mơi trường để cĩ nồng độ 60ppm.
+ Cơng thức 4: Bổ sung dung dịch chitosan vào mơi trường để cĩ nồng độ 80ppm.
+ Cơng thức 5: Bổ sung dung dịch chitosan vào mơi trường để cĩ nồng độ 100ppm.
+ Cơng thức 6: Bổ sung dung dịch chitosan vào mơi trường để cĩ nồng độ 200ppm.
+ Cơng thức 7: Đối chứng là mơi trường khơng cĩ chitosan ( 0ppm). - Lấy 50ml dung dịch ở mỗi cơng thức và đối chứng cho vào 1ml dung dịch vi khuẩn, để 24 giờ ở nhiệt độ phịng.
- Sau đĩ đếm mật độ vi khuẩn trong 1ml dung dịch pha lỗng bằng cách trải ra trên mơi trường thạch Nutrient Broth.
+ Pha lỗng dung dịch: lấy 9ml nước cất cho vào các ống nghiệm, lấy 1ml dung dịch ở mỗi cơng thức và đối chứng sau khi hấp phụ vi khuẩn cho vào ống nghiệm 1, lắc đều. Sau đĩ hút 1ml dung dịch từ ống 1 cho vào ống 2 rồi lắc đều và tiếp tục như vậy sang các ống tiếp theo cho đến nồng độ cần pha. Hút 0,1 ml dịch các ống cĩ nồng độ cần đếm trải trên đĩa thạch, nuơi trong tủ ấm sau 24 giờ.
- Đếm mật độ vi khuẩn được áp dụng theo cơng thức:
N
A ( CFU / ml ) =
n1Vf1 + ... niVfi Trong đĩ:
A: là số tế bào ( đơn vị hình thành khuẩn lạc ) vi khuẩn trong một g hay 1ml mẫu
N: là tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa petri đã chọn ni: là số đĩa được giữ lại ở độ pha lỗng thứ i
V: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa fi: độ pha lỗng tương ứng
- Phương pháp xác định tỉ lệ chết của vi khuẩn: B - K I (%) = . 100% B Trong đĩ: I (%) : tỉ lệ vi khuẩn chết
B: Mật độ vi khuẩn trong mơi trường ( 0ppm) K: Mật độ vi khuẩn ở nồng độ k
-Tất cả các vật liệu và dụng cụ thí nghiệm đều được vơ trùng. -Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
+ Chỉ tiêu theo dõi
- Mật độ vi khuẩn trong mỗi cơng thức. -Tỉ lệ vi khuẩn bị chết.
3.2.5.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano chitosan đến khả năng kháng khuẩn
- Nội dung nghiên cứu nhằm tìm ra nồng độ tối ưu của hạt nano chitosan trong kháng khuẩn.
Sử dung hạt nano chitosan từ 300kDa, ( CS:TPP = 6:1), tốc độ khuấy 900 vịng/ phút trong 60 phút ở nhiệt độ 30o C làm thí nghiệm.
- Thiết kế thí nghiệm: mỗi tỉ lệ gồm 4 cơng thức và đối chứng:
+ Cơng thức 1: Đưa hạt nano chitosan vào mơi trường được nồng độ 20ppm.
+ Cơng thức 2: Đưa hạt nano chitosan vào mơi trường được nồng độ 40ppm.
+ Cơng thức 3: Đưa hạt nano chitosan vào mơi trường được nồng độ 60ppm.
+ Cơng thức 4: Đưa hạt nano chitosan vào mơi trường được nồng độ 80ppm
+ Đối chứng: Mơi trường Nutrient Broth (nồng độ 0ppm), chitosan bổ sung vào mơi trường với nồng độ 20ppm, 40ppm, 60ppm, 80ppm,100ppm, 200ppm.
-Thử nghiệm trên đối tượng là vi khuẩn E.coli và S.aureus.
-Thực hiện tương tự như thí nghiệm trên.
+ Chỉ tiêu theo dõi
- Mật độ vi khuẩn trong mỗi cơng thức . - Tính tỉ lệ chết của vi khuẩn.
-Tìm nồng độ kháng khuẩn tối ưu của hạt nano chitosan
3.2.5.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử chitosan đến khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan.
- Nội dung nhằm tìm ra khối lượng chitosan tốt nhất cho tính kháng khuẩn của hạt nano chitosan
- Hạt nano chitosan được tạo từ chitosan cĩ khối lượng phân tử 20kDa, 30kDa, 300kDa với tỉ lệ CS:TPP= 6:1, tốc độ khuấy 900 vịng/ phút trong 60 phút ở nhiệt độ 30o C làm thí nghiệm.
- Thiết kế thí nghiệm:
+ Mỗi loại hạt nano chitosan cĩ khối lượng 20kDa, 30kDa,300kDa thực hiện gồm 4 cơng thức:
- Cơng thức 1:Bổ sung hạt nano chitosan vào mơi trường được nồng độ 20ppm.
- Cơng thức 2:Bổ sung hạt nano chitosan vào mơi trường được nồng độ 40ppm
- Cơng thức 3:Bổ sung hạt nano chitosan vào mơi trường được nồng độ 60ppm.
- Cơng thức 4:Bổ sung hạt nano chitosan vào mơi trường được nồng độ 80ppm.
+ Mơi trường Nutrient Broth.
- Thử nghiêm trên đối tượng là vi khuẩn E.coli và S.aureus.
- Cách làm tương tự như thí nghiệm trên. - Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
+ Chỉ tiêu theo dõi
- Tính mật độ vi khuẩn ở từng nhĩm cơng thức. - Tính tỉ lệ chết ở mỗi cơng thức.
- Tìm ra khối lượng tối ưu cho tính kháng khuẩn của hạt nano chitosan.
3.2.5.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ CS: TPP ( 4:1; 5:1; 6:1) đến khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan.
- Nội dung nhằm tìm ra tỉ lệ CS : TPP tốt nhất cho tính kháng khuẩn của hạt nano chitosan.
- Sử dụng chitosan cĩ khối lượng MIC của thí nghiệm trên là 300kDa tạo ba loại hạt nano chitosan với tỉ lệ CS:TPP là 4:1; 5:1 và 6:1.
- Thiết kế thí nghiệm:
+ Mỗi loại hạt nano chitosan trên thực hiện gồm 4 cơng thức:
- Cơng thức 1: Bổ sung hạt nano chitosan vào mơi trường được nồng độ 20ppm.
- Cơng thức 2:Bổ sung hạt nano chitosan vào mơi trường được nồng độ 40ppm
- Cơng thức 3:Bổ sung hạt nano chitosan vào mơi trường được nồng độ 60ppm.
- Cơng thức 4:Bổ sung hạt nano chitosan vào mơi trường được nồng độ 80ppm.
- Thử nghiêm trên đối tượng là vi khuẩn E.coli và S.aureus.
- Cách làm tương tự như thí nghiệm trên. - Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
+ Chỉ tiêu theo dõi
- Tính mật độ vi khuẩn ở từng cơng thức. - Tính tỉ lệ chết ở mỗi cơng thức.
- Tìm ra tỉ lệ CS:TPP tối ưu cho khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan.
3.2.5.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH mơi trường đến khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan.
- Nội dung này nhằm tìm ra pH mơi trường tối ưu cho tính kháng khuẩn của hạt nano chitosan.
- Sử dụng MIC của các thí nghiệm trên là hạt nano chitosan cĩ khối lượng phân tử 300KDa , tỉ lệ CS:TPP là 6:1, tốc độ khuấy 900 vịng/ phút ở nhiệt độ phịng 30o C trong 60 phút, nồng độ 60ppm. Các yếu tố thí nghiệm là pH mơi trường thay đổi từ 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 và 7.0.
- Thiết kế thí nghiệm: gồm 6 cơng thức và mơi trường Nutrient Broth. + Cơng thức 1: pH mơi trường là 4.5
+ Cơng thức 2: pH mơi trường là 5,0 + Cơng thức 3: pH mơi trường là 5,5 + Cơng thức 4: pH mơi trường là 6,0 + Cơng thức 5: pH mơi trường là 6,5 + Cơng thức 6: pH mơi trường là 7,0
- Thử nghiệm trên đối tượng là vi khuẩn E.coli và S.aureus.
+ Hạt nano chitosan đưa vào mơi trường Nutrient Broth cĩ nồng độ 60ppm. Cho vào các bình tam giác: mỗi bình 50ml dung dịch trên rồi chuẩn độ pH ở 6 cơng thức trên.
+ Bình 7 là 50ml mơi trường Nutrient Broth
+ Đưa 1ml vi khuẩn vào mỗi bình, ủ 24 giờ ở nhiệt độ phịng.
+ Đếm mật độ vi khuẩn sau 24 giờ trong 1ml dung dịch pha lỗng: cách làm như thí nghiệm trên.
+ Tính tỉ lệ vi khuẩn chết.
Thí nghiệm lặp lại 3 lần, các thao tác và dụng cụ đều vơ trùng.
+Chỉ tiêu theo dõi
- Đếm mật độ vi khuẩn ở mỗi cơng thức
-Tính tỉ lệ chết ở mỗi cơng thức để tìm ra pH mơi trường tối ưu cho tính kháng khuẩn của hạt nano chitosan.
3.3. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được thu thập và xử lý thống kê theo phần mềm MSTATC và phân hạng theo trắc nghiệm LSD 0.05 và 0.01.
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Nghiên cứu qui trình tạo hạt nano chitosan bằng phương pháp tạo gel ion trong TPP gel ion trong TPP
4.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử đến kích thước hạt, điện tích và tính ổn định hạt nano chitosan