Doxycycline và Chitosan nanoparticles
Vi khuẩn Doxycyline CNP CNP-Cu
MIC MBC MIC MBC MIC MBC
E. coli K88 1 8 1/8 4 1/16 2 E. coli ATCC 25922 2 16 1/16 2 1/16 2 S. choleraesuis ATCC 50020 4 32 1/8 4 1/16 2 S. typhinurium ATCC 50013 4 64 ¼ 8 1/8 4 S. aureus ATCC 2593 ¼ 8 ¼ 8 1/8 4
CNP: chitosan nanoparticles, CNP-Cu: chitosan nanoparticles hấp thụ Cu
2.3.8. Hoạt tính chống đơng máu của dẫn xuất sulfated chitosan
Hiện tượng đơng máu liên quan đến sự hoạt động liên tiếp của một loạt các enzyme serine proteinases, nhất là thrombin xúc tác sự chuyển đổi fibrinogen thành fibrin khơng tan. Khả năng của sulfated glycosaminoglycans can thiệp vào quá trình đơng máu đã được thử nghiệm lâm sàng rộng rãi và cĩ ý nghĩa thiết thực. Heparin, như là một tác nhân chống thrombin hiệu quả, đã sử dụng lâm sàng trong thời gian dài. Theo Doczi và Wolfrom (1953) cơng bố so với heparin, chitosan sulfate cĩ tiềm năng kháng đơng cao bằng khoảng 45% nhờ cĩ cấu trúc hĩa học tương tự heparin.
Sulfat hĩa đã được thực hiện bằng cách sử dụng axit chlorosulfonic trong N, N-dimethylformamide ở nhiệt độ phịng để tránh phân hủy chitosan. Khơng giống heparin, sulfated chitosan khơng thấy thể hiện hoạt tính chống
đơng máu, gây chảy máu quá mức ở bệnh nhân. Một mức độ sulfate hĩa cao hơn được thể hiện là cĩ lợi cho sự kháng đơng, với sự đánh giá thời gian thrombin. Sự sắp xếp của nhĩm sulfate được cho thấy cĩ ảnh hưởng lớn quá trình kháng đơng, ví dụ, nhĩm C-6 sulfate đã là một chìa khĩa cần thiết, vì sự desulfation của nĩ dẫn đến mất hoạt tính. Sự thay đổi hĩa học của chitosan sulfate cũng được quan tâm nghiên cứu bởi vì nĩ sẽ làm gia tăng sự giống nhau về cấu trúc của chitosan sulfate và cấu trúc của heparin. Hoạt tính kháng đơng của polysaccharides sulfate nĩi chung là kết quả từ sự tương tác giữa các nhĩm sulfate tích điện âm với chuỗi peptid tích điện dương. Nhĩm
N-acetyl cũng cho thấy sự cải thiện hoạt tính kháng đơng.
2.3.9.Ứng dụng làm tá chất cho vaccin
Nhờ đặc tính khơng độc, khơng gây phản ứng phụ, cĩ khả năng kích thích hệ thống miễn dịch của tế bào mà chitosan và đặc biệt là hạt nano chitosan được tập trung nghiên cứu làm tá chất cho vaccine. Maletter (1984) [30] đã chứng minh khả năng tăng cường hoạt động của hệ thống miễn dịch của một số dẫn suất chitin trong invivo. Maletter chỉ ra rằng chitin cĩ mức độ deacetyl hĩa 70% kích thích miễn dịch trung gian tế bào và tăng cường hình thành kháng thể đặc hiệu trong thí nghiệm trên chuột và heo Guinea. Shibata (1996) cũng cơng bố chứng minh các hạt chitin và chitosan cĩ khả năng cảm ứng tăng tổng hợp interferon gamma và đại thực bào. Các tác giả cũng khẳng định khả năng kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể phụ thuộc rất nhiều vào mức độ deacetyl hĩa, khối lượng phân tử và nhĩm thế trên chitin, chitosan.
Illum (2001) nghiên cứu cho thấy chitosan như là một tá chất mới cho vaccin. Kết quả đáp ứng miễn dịch ở lơ thí nghiệm kháng nguyên cúm là rất thấp, chỉ số IgG chỉ là 102 trong khi ở tá chất chitosan là 103 ở lần chủng thứ
nhất. Ở lần nhắc hai, đối chứng antigen là 102 và tá chất chitosan là 105 [13].Van der Lubben (2001) nghiên cứu sử dụng chitosan làm tá chất cho vaccin qua niêm mạc mũi.
Nhờ cĩ kích thước nanomet và tích điện tích dương nên chitosan dễ dàng đi qua tế bào biểu mơ vào trong tế bào và thải chậm vaccine để kích thích miễn dịch. Do cĩ khả năng thải chậm (slow release) nên đáp ứng miễn dịch sẽ kéo dài và ổn định hơn [53].
Ana Vila (2004) nghiên cứu sử dụng hạt nano chitosan để mang vaccin tetanus qua niêm mạc mũi. Kích thước hạt nano là 350 nm, điện tích là + 40mV, cĩ hiệu suất mang vaccin tetanus là 50-60%. Kháng thể IgG ở thí nghiệm sử dụng hạt nano chitosan cao gấp 5 lần so với sử dụng kháng nguyên tetanus tự do sau 2 tuần, tăng gấp 15 lần sau 12 tuần và 25 lần sau 24 tuần. Kháng thể đặc hiệu ở thí nghiệm sử dụng hạt nano chitosan cao hơn so với đối chứng gấp 2.5 lần và tăng lên theo thời gian từ 2-24 tuần [6].
Zaharoff (2007) cơng bố nghiên cứu cho thấy dung dịch chitosan tăng cường đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào và miễn dịch dịch thể. Chitosan làm tăng kháng thể đặc hiệu kháng nguyên lên 4 lần so với đối chứng và CD4
Hình 2.8. Cơ chế xâm nhập qua màng của chitosan mang vaccin cĩ kích thước nm khác nhau (Van der Lubben ,2001) thước nm khác nhau (Van der Lubben ,2001)
đặc hiệu kháng nguyên lên 6 lần. So sánh với các tá chất (adjuvant) truyền thống như Freund và hydroxyt nhơm thì chitosan làm tá chất tương đương với tá chất Freund và tốt hơn nhiều so với hydroxyt nhơm. Chitosan làm tăng số lượng tế bào lympho trong hạch lympho lên 67% ở ngày thứ 14 sau tiêm. Đồng thời chitosan cũng làm tăng số lượng tế bào NK 1.1+ và CD 11b+ trong hạch lympho. Trong mơ hình thí nghiệm của Zaharoff chứng minh antigen trong PBS chỉ tồn tại trong mơ bào 3 giờ sau tiêm, trong khi đĩ antigen hấp phụ trên chitosan cĩ thể duy trì tới hơn 7 ngày. Trong thời gian 7 ngày lượng antigen được phĩng thích khoảng 60%.
Le Van Hiep, Nguyen Anh Dung, Vo Thi Phuong Khanh (2008) nghiên cứu sử dụng chitosan oligomer (dp=8-16) làm tá chất cho vaccin cúm A H5N1. Kết quả cho thấy chitosan oligomer đã kích thích đáp ứng miễn dịch sớm và tăng cường kháng thể đặc hiệu cúm cúm A H5N1.
Hình 2.9. Ảnh hưởng của các loại adjuvant lên đáp ứng miễn dịch của chuột với vaccin cúm H5N1 chuột với vaccin cúm H5N1
Hình 2.10. Ảnh hưởng của chitosan và các tá chất khác đến đáp ứng miễn dịch của chuột với vaccin H5N1(a) và hiệu giá kháng thể (HIU) (b).
Nhĩm 1: Đối chứng (kháng nguyên cúm A H5N1) Nhĩm 2: Hydroxyt nhơm + kháng nguyên cúm A H5N1.
Nhĩm 3: Chitosan oligomer (1mg/ml) + kháng nguyên cúm A H5N1. Nhĩm 4: Chitosan oligomer (2mg/ml) + kháng nguyên cúm A H5N1.
Nhĩm 5: Freund + kháng nguyên cúm A H5N1 [23].
2.3. Tổng quan về Escherichia coli và Staphylococcus aureus
2.3.1 Vi khuẩn Escherichia coli
2.3.1.1. Giới thiệu chung
Trực khuẩn ruột già Escherichia coli cịn cĩ tên là Bacterium colicommure,
Bacillus colicommunis được phân lập vào năm 1885 bởi Eschirich từ phân
của những trẻ em bị viêm đường ruột, sống bình thường trong ruột người và lồi vật, nhiều nhất ở ruột già (vùng hồi manh tràng). Người ta nhận thấy rằng
Escherichia coli phát tán rất rộng lớn ở trong ruột của trẻ em, người lớn và
những động vật cĩ vú khác. Vi khuẩn thường theo phân ra ngồi thiên nhiên, do đĩ ta thường thấy trong nước, đất, khơng khí. Vi khuẩn Escherichia coli
thường sống hội sinh với nhau, là những sinh vật cĩ khả năng tiềm tàng gây ra các bệnh về đường ruột. Sự phân biệt giữa các độc tố của vi rút và các độc tố vi khuẩn Escherichia coli được xác định bằng cách sử dụng phương pháp phân loại huyết thanh. Phương pháp này lần đầu tiên được ứng dụng để nghiên cứu về dịch bệnh đường ruột ở trẻ em và sau đĩ được Kaufmann phát triển thành một hệ thống huyết thanh là nền tảng cho việc nghiên cứu ngày nay. Trong cuối những năm 1940, nhiều giống vi khuẩn Escherichia coli liên quan đến bệnh tiêu chảy đã được nhận biết dựa trên cơ sở kháng nguyên O
soma của chúng, và sự phân chia các giống thành những lồi vi khuẩn cĩ khả năng gây bệnh và sống hội sinh được hình thành .
Vai trị của vi khuẩn Escherichia coli nguyên nhân gây ra bệnh tiêu chảy ngày càng được thừa nhận trên 25 năm qua. Những sự ảnh hưởng của thú y này được mơ tả một cách tồn diện gần đây. Sự vận chuyển của vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh tiêu chảy qua đường động vật được xem là chủ yếu. Nĩ là mối đe doạ đến sức khoẻ của con người do sự nhiễm bẩn của thực phẩm hoặc là bằng cách tiếp xúc trực tiếp. Ngồi những bệnh về tiêu chảy, các chủng vi khuẩn Escherichia coli cịn thường gây ra các bệnh lây nhiễm qua đường nước tiểu và các bệnh về ruột thừa.
2.3.1.2. Đặc điểm vi sinh học
Năm 1885 Escherich phát hiện ra giống Esherichia. Theo phân loại của Eving năm 1986, giống này thuộc bộ Escherichiae, họ Enterobacteriaceae, lồi điển hình là Escherichia coli. Giống Escherichia là một phần của bộ
Escherichiae,thuộc gia đình vi khuẩn Entero – bacteriaceae và bao gồm cĩ 5
lồi. Các lồi gồm là E.hermanii, E.fergusonii và E.vulneris tất cả những lồi này được tách ra từ các nguồn gốc khác nhau của cơ thể bao gồm cả ruột và ruột thừa, lồi E.blattae là lồi chỉ được tách ra từ con gián. E.coli là lồi lớn nhất của giống này.
2.3.1.2.1.Hình thái
Vi khuẩn Escherichia coli là trực khuẩn Gram âm, hình que. Kích thước dài hay ngắn tùy thuộc mơi trường nuơi cấy, thường vào khoảng 1 ÷ 1,5 ìm × 2 ÷6 ìm. Một số vi khuẩn di động được nhờ tiên mao (lơng roi ), một số lại bất động, một số cĩ nang. Vi khuẩn khơng sinh bào tử.
2.3.1.2.2. Điều kiện nuơi cấy
Vi khuẩn Escherichia coli thuộc loại kị khí khơng bắt buộc. Nhiệt độ thích hợp nhất để phát triển là 37oC. Tuy nhiên cĩ thể tăng trưởng từ 15
÷40oC . Cĩ nhiều nhĩm vi khuẩn Escherichia coli cĩ thể chịu được ở nhiệt độ cao 55oC khoảng 60 phút và thậm chí đến 60oC khoảng 15 phút. pH phát triển tối ưu của E.coli là 4,4.
Trong mơi trường lỏng, sau 4-5h Escherichia coli làm đục nhẹ mơi trường, càng để lâu đục càng nhiều và sau vài ngày cĩ thể cĩ váng mỏng trên bề mặt mơi trường. Để lâu vi khuẩn lắng xuống đáy. Trên mơi trường thạch thường sau 18-24h tạo khuẩn lạc trơn, bờ đều, bĩng, khơng màu hay màu xám nhẹ, đường kính 2-3 mm. Trên mơi trường phân lập, vi khuẩn thường làm thay đổi màu của mơi trường vì lên men đường lactose. Khuẩn lạc cĩ màu vàng trên mơi trường Istrati và màu đỏ trên mơi trường SS.
2.3.1.2.3. Đặc điểm trao đổi chất
Escherichia coli sống ở ruột già của người và của động vật, theo phân
người và gia súc ra thiên nhiên.
E.coli lên men được nhiều loại đường glucose, lactose, sinh ra sản
phẩm của acid và hơi (ngoại trừ một số chủng EIEC khơng lên men đường lactose và khơng sinh hơi), cĩ khả năng khử nitrate thành nitrite.
E.coli cĩ enzyme trytophanase. Nếu trong mơi trường cĩ trytophan, chúng sẽ phân giải trytophan thành indol.
Một số hố chất ngăn chặn được sự phát triển của E.coli như Chlorine và các dẫn xuất, muối mật, Brillant green, Sodium deoxycholate, Sodium tetrathionate, Selenite …
2.3.1.2.4.Kháng nguyên
E.coli cĩ khoảng 150 yếu tố O, 100 yếu tố K và 50 yếu tố H. Dựa vào cơng thức kháng nguyên O, K và H người ta phân biệt E.coli được chia thành rất nhiều tuýp huyết thanh khác nhau.
Kháng nguyên O là kháng nguyên của thành tế bào. Cấu tạo bởi lipopolysaccharit. Đặc tính của kháng nguyên O là :
- Chịu được nhiệt, khơng bị huỷ khi đun nĩng 100oC trong hai giờ. - Kháng cồn, khơng bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%.
- Bị hủy bởi focmol 5%.
- Rất độc, chỉ cần 1/20mg đủ giết chết chuột sau 24 giờ.
Kháng nguyên H ( kháng nguyên tiêu hao). Chúng được cấu tạo bởi protein,cĩ các tính chất sau :
- Khơng chịu nhiệt. - Bị hủy bởi cồn 50%. - Bị hủy bởi các protease. - Khơng bị hủy bởi focmol 5%.
Kháng nguyên K ( kháng nguyên màng tế bào). Loại này chỉ cĩ ở một số vi khuẩn đường ruột. Được cấu tạo bởi polysaccharit hoặc là protein.
Căn cứ vào kháng nguyên O, K, H người ta chia Escherichia coli thành nhiều nhĩm khác nhau:
- EPEC ( Enteropathogenic E.coli ) : gây bệnh đường ruột, gây tiêu chảy ở trẻ em vào mùa hè, gây dịch ở nhà trẻ, EPEC bám dính vào bề mặt tế bào ruột, huỷ hoại tổ chức tại chổ.
- ETEC ( Enterotoxigenic E.coli ) : sinh độc tố ruột, gây tiêu chảy ở trẻ em và người du lịch, cĩ hai loại độc tố chính : khơng chịu nhiệt (LT) và chịu nhiệt (ST).
- EIEC ( Enteroinvasive E.coli ) : E.coli xâm nhập ruột, thường gây ra các vụ dịch do thực phẩm, giống như Shigella
- EHEC ( Enterohaemorrhagic E.coli ) : E.coli gây xuất huyết đường ruột, là bệnh viêm đại tràng xuất huyết lây lan qua đường ăn uống, gây hội chứng tan máu, urê huyết cao, chống (HUS), thường do E.coli O157:H7 gây ra.
- EAggEC ( Enteroaggregative E.coli ) : E.coli bám dính đường ruột giống như nhĩm EPEC.
Đây là những chủng vi khuẩn cĩ liên quan đến bệnh tiêu chảy ở người. Những vi khuẩn này thường cĩ trong những động vật dùng để sản xuất thực phẩm.
2.3.1.2.5.Khả năng gây bệnh
Khả năng gây bệnh rất đa dạng. Ở phụ nữ 90% trường hợp nhiễm khuẩn đường tiểu lần đầu là do E.coli, khi đĩ sẽ dẫn tới tiểu lắt nhắt, tiểu đau, tiểu ra máu, tiểu ra mủ. Trong trường hợp cơ thể yếu, sức đề kháng giảm E.coli sẽ vào máu gây nhiễm khuẩn máu. E.coli cĩ thể gây viêm màng não (khoảng 40% viêm màng não ở trẻ sơ sinh). Phần lớn các vụ tiêu chảy là do
E.coli gây ra. Những biểu hiện lâm sàng do nhiễm khẩn E.coli tùy thuộc vào
vị trí mà vi khuẩn xâm nhập, thường thấy nhất là :
Nhiễm khuẩn đường tiểu :
Khoảng 90% trường hợp nhiễm khuẩn đường tiểu lần đầu ở phụ nữ là do
E.coli, với các triệu chứng : tiểu lắt nhắt, tiểu đau, tiểu ra máu, tiểu ra mủ. Cĩ
thể đưa tới nhiễm khuẩn bọng đái, thận, cơ quan sinh dục và nhiễm khuẩn huyết.
Nhiễm khuẩn huyết :
Khi sức đề kháng của cơ thể giảm , vi khuẩn vào máu gây nhiễm khuẩn máu. Gặp ở trẻ sơ sinh và sau khi nhiễm khuẩn đường tiểu .
Viêm màng não
E.coli và Streptococci nhĩm B là những nguyên nhân hàng đầu gây
viêm màng não ở trẻ em . Vi khuẩn E.coli chiếm khoảng 40% trường hợp gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh, trong đĩ 75% E.coli cĩ kháng nguyên K1. Nguyên nhân tại sao độc tính của vi khuẩn lại liên hệ với kháng nguyên K1 thì chưa rõ.
Tiêu chảy
Trước đây E.coli được xem là những vi khuẩn thường trú ở trong ruột người và động vật, gây tiêu chảy nhưng ít được đề cập đến. Nhưng cùng với những tiến bộ của kỹ thuật xét nghiệm, càng ngày người ta càng phát hiện ra nhiều chủng E.coli gây tiêu chảy. Ngày nay, E.coli được xem là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tiêu chảy đặc biệt là ở trẻ em. Bệnh gặp khắp nơi trên thế giới ở các nước phát triển lẫn đang phát triển.
2.3.2. Vi khuẩn Staphylococcus aureus
2.3.2.1. Giới thiệu chung
Staphylococcus aureus là loại vi khuẩn gây bệnh thường hay gặp nhất, nĩ cĩ vai trị và ý nghĩa đối với y học, khoảng 30% người khỏe mạnh mang vi khuẩn này ở trên da và trên niêm mạc, khi cĩ những tổn thương ở da và niêm mạc hoặc những rối loạn về chức năng thí các nhiễm trùng do Staphylococcus
aureus dễ dàng xuất hiện. Staphyloccocus aureus cũng gây nên các nhiễm
trùng ở lồi gia súc nhất là trong những cơ sở chăn nuơi tập trung cĩ mật độ đàn gia súc lớn gây thiệt hại đáng kể về kinh tế. Những nhiễm trùng do
Staphylococcus aureus cĩ thể gây nên nhiều biểu hiện khác nhau, như các
nhiễm trùng của da, của các tổ chức dưới da hoặc trong các cơ quan nội tạng, gây mưng mủ điển hình, một số trường hợp chuyển sang chứng huyết nhiễm trùng, chứng bại huyết. Staphylococcus aureus cịn cĩ khả năng hình thành độc tố trong thực phẩm, do đĩ nĩ cĩ thể gây nên chứng nhiễm độc.
2.3.2.2. Đặc điểm vi sinh học 2.3.2.2.1. Đặc điểm hình thái
Staphylococcus aureus là một trong ba loại thuộc giống tụ cầu khuẩn, đường kính 0.7-1µm, khơng di động, khơng sinh nha bào và thường khơng cĩ vỏ, khơng cĩ lơng. Khi nhuộm phương pháp Gram thì vi khuẩn bắt màu Gram dương.
2.3.2.2.2. Đặc điểm nuơi cấy
Staphylococcus aureus sống hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện, nhiệt độ thích hợp 32-370C, pH thích hợp từ 5.5-7.6. Dễ mọc trên các mơi trường nuơi cấy thơng thường, sinh sắc tố trên mơi trường nuơi cấy. Chịu được nồng độ muối 12% và nồng độ đường 50%.
Mơi trường nước thịt (bổ sung NaCl 0.5%) hay mơi trường nước mắm ( độ đạm cao) và pepton : sau khi cấy 5-6h, vi khuẩn đã làm đục mơi trường, sau 24h mơi trường đục rõ ràng hơn, lắng cặn nhiều, khơng cĩ màng.
Mơi trường thạch thường : sau khi nuơi cấy khỏang 24h, vi khuẩn hình