Phương pháp này cĩ thể được cải tiến hơn bằng cách nhỏ dung dịch sodium sulfate vào dung dịch chitosan (pH acid) trong điều kiện khuấy nhẹ và tác động của sĩng siêu âm (ultrasonic). Hạt nano chitosan thu bằng cách ly tâm, sau đĩ tiếp tục bước làm cho cứng và bền hơn bằng cách khâu mạch với glutaraldehyde.
2.2.1.4. Phương pháp sấy phun (spray-drying)
Sấy phun là kỹ thuật thường ứng dụng trong dược phẩm, thực phẩm để tạo bột, tạo hạt thực phẩm như sữa, tạo bột thuốc với tá dược. Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc dung dịch huyền phù (suspension) được làm khơ khi được phun trong dịng khơng khí nĩng.
Chitosan được hịa tan thành dung dịch, dược phẩm được hịa tan vào dung dịch chitosan, sau đĩ bổ sung hoạt chất khâu mạch (cross-liking agent) và được phun vào dịng khơng khí nĩng .
Hình 2.5. Sơ độ tạo hạt bằng phương pháp sấy phun
2.2.1.5. Phương pháp tạo mixel ngược pha (reverse micella )
Trong phương pháp này, các chất hoạt động bề mặt (surfactant) được hĩa tan trong dung mơi hữu cơ để tạo hệ mixel ngược pha. Sau đĩ dung dịch chitosan được thêm vào và được vortex để tránh bị đục. Tiếp theo, dung dịch chất khâu mạch được thêm vào. Quá trình khâu mạch được thực hiện qua đêm và khuấy đều. Sau đĩ cho bay hơi dung mơi hữu cơ và chất hoạt động bề mặt cũng được kết tủa bằng muối, cuối cùng hỗn hợp được ly tâm và thu được hạt nano chitosan như trong sơ đồ 2.5.
Hình 2.6. Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp mixel ngược pha
Ngồi ra nano chitosan cịn cĩ thể được chuẩn bị khi phối hợp với polyethylene glycon (PEG). Hoặc phủ bên ngồi một lớp alginate để tăng hiệu quả của nano chitosan mang vaccin viêm gan B qua đường uống. Kích thước hạt nano chitosan nằm trong khoảng 100 nm.
2.3. Ứng dụng của chitin, chitosan và các dẫn suất trong y học
Nhờ những đặc tính ưu việt của chitin, chitosan là sản phẩm tự nhiên, khơng độc, phân hủy sinh học, tương hợp sinh học cùng với các hoạt tính sinh học của chúng như hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, kích thích hoạt động của hệ thống miễn dịch dẫn đến chitin, chitosan được ứng dụng rộng rãi trong y dược học.
Đã cĩ rất nhiều thử nghiệm đã được tiến hành để xác nhận tính an tồn của chitosan như: thử nghiệm khả năng gây đột biến; khả năng gây độc cấp tính, bán cấp tính và mãn tính; khả năng gây sốt, làm tan máu và gây dị ứng.
Bảng 2.3. Các tính chất cơ bản của chitosan liên quan đến ứng dụng trong sinh y học (Rinaudo, 2006) [43]. sinh y học (Rinaudo, 2006) [43].
Các ứng dụng trong sinh y học Tính chất của chitosan
Chỉ khâu trong phẫu thuật Tương hợp sinh học, phân hủy sinh học
Cấy ghép trong nha khoa Tương hợp sinh học, phân hủy sinh học
Da nhân tạo Kích thích tái sinh da mới
Tái tạo xương Khả năng tạo màng film
Kính áp trịng Tạo màng ưa nước trong suốt
(hydrogels)
Vật liệu ly giải chậm thuốc Khơng độc, tương hợp sinh học
Bao nang thuốc Kháng khuẩn, kháng nấm, phân hủy
sinh học
Số liệu ghi nhận trên thỏ, gà mái và gà giị khi được cho ăn chitosan với liều lượng 0,7- 0,8g/kg khối lượng cơ thể/ngày trong 239 ngày là khơng cĩ triệu chứng bất thường nào. Khả năng tiêu hố chitosan ở thỏ là 28- 38% cịn ở gà mái, gà giị là tiêu hĩa hồn tồn. Khi tiêm chitosan và các phân đoạn chitosan vào thỏ với liều lượng 4,5mg/kg khối lượng cơ thể/ ngày trong 7-11 ngày, khơng phát hiện được biểu hiện bất thường nào. Trong nghiên cứu kéo dài 12 tuần trên người, khơng cĩ triệu chứng lâm sàng nào được ghi nhận ở những người uống chitosan trong so với những người uống thuốc giả. Chỉ cĩ 2,6 – 5,4% đối tượng cĩ triệu chứng buồn nơn và táo bĩn tuy nhiên rất nhẹ và tạm thời. Với tất cả các bằng chứng trên, việc ứng dụng các thuộc tính quý giá của chitosan trong lĩnh vực y sinh là hồn tồn hợp lý.
2.3.1.Hoạt tính kháng ung thư
Chitosan oligomer kích thích đại thực bào và cho hoạt tính chống ung thư và được sử dụng trong cơng thức thực phẩm chức năng (Jeon, Shahidi, & Kim, 2000),[15]. Chitosan khối lượng phân tử thấp (LMWC) 20 kDa ngăn cản sự tiến triển của bệnh tiểu đường và biểu hiện cấu trúc tương tự lipopolysaccharid cao hơn chitosan Mw 140 kDa. Tác động cầm máu và hoạt tính chống ung thư (Malette & Quigley, 1984),[30]. Hoạt động sinh lý mạnh nhất được biểu hiện bởi oligosaccharide cĩ độ dài chuỗi lớn hơn pentasaccharide. Hexa-N-acetylchitohexaose [(GlcNAc)]6 cĩ nhiều hứa hẹn tăng cường hoạt động của hệ thống miễn dịch và hoạt tính chống ung thư.
Hạt nano chitosan cũng đang được nghiên cứu để chống ung thư hiệu quả hơn. Mitra (2001) nghiên cứu nhốt thuốc kháng ung thư doxorubicine để ức chế khối u trên chuột. Kết quả cho thấy nếu tiêm doxorubicine độc lập thì khối u ở chuột vẫn tăng lên 900 mm3 sau 50 ngày và chết, trong khi đĩ ở thí nghiệm ly giải chậm doxorubicine trong hạt nano chitosan kích thước khối u giảm chỉ cịn 170 mm3 và chuột vẫn sống khi 90 ngày thí nghiệm [33].
L. Qi et al. (2004) nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư trực tiếp của hạt nanochitosan dựa trên cơ chế polycation gây phá vỡ màng tế bào ung thư và hoạt tính cảm ứng apoptosis trên hai dịng tế bào ung thư là sarcoma S180 và hepatoma H22. Kết quả cho thấy hiệu quả làm giảm khối lượng tế bào ung thư với liều uống 2.5 mg/kg hạt nano chitosan trên S 180 và H 22 là 52-59% và liều 0.5mg/kg là 43-53%, trong khi đĩ chitosan chỉ là 30% [25].
Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy kích thước hạt nano càng nhỏ thì hiệu quả kháng ung thư càng cao. Kích thước hạt nano khoảng 350 nm. Hiệu quả chống ung thư khi sử dụng hạt nano chitosan rất cao trên tế bào gây ung thư phổi ở chuột A549 đồng thời làm giảm độc tính của thuốc chống ung thư.
2.3.2.Giảm cholesterol trong máu (hypocholesterolemic activity)
Đã cĩ rất nhiều nghiên cứu chứng minh khả năng giảm cholesterol và mỡ trong máu của chitosan. Omrod (1998) thí nghiệm trên mơ hình chuột quá dư thừa cholesterol trong máu do thiếu apolipoprotein E được tiến hành trong 20 ngày. Mỗi ngày chuột thí nghiệm được ăn 5% chitosan trong khẩu phần thức ăn cịn lơ đối chứng thì khơng được cho ăn chitosan. Hàm lượng cholesterol trong máu giảm đáng kể sau 20 tuần, chỉ cịn 64% so với lơ đối chứng. Ngồi ra, khả năng ức chế xơ vữa động mạch của chuột được ăn chitosan ở động mạch chủ là 42% và cung động mạch chủ là 50%. Chuột được ăn chitosan cũng lớn nhanh hơn rõ rệt [40] .Thí nghiệm này cũng mở ra khả năng ức chế sự phát triển chứng xơ vữa động mạch trong điều trị bệnh cho người quá dư thừa hàm lương cholesterol trong máu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Do lợi ích giảm nồng độ cholesterol trong huyết tương, đĩng vai trị quan trọng trong sự giảm bớt và điều trị các bệnh tim mạch, chitosan đã trở thành một thành phần ăn kiêng hữu ích. Hoạt động giảm cholesterol trong máu của chitosan được giải thích là nhờ vào giảm hấp thụ cholesterol và sự can thiệp và hấp thu acid mật, một cơ chế tương tự với chế độ ăn kiêng các thành phần sợi. Hoạt động giảm cholesterol của chitosan qua đường uống được báo cáo nhiều (Sugano, Watanabe, Kishi, Izumi, & Ohtakara, 1988)[46] trong khi chitin, mặc dù biểu hiện sự tiết triglycerides trong phân cao hơn, nhưng khơng biểu thị hoạt tính giảm cholesterol.
2.3.3.Đặc tính chống oxi hĩa
Xu hướng hiện nay sử dụng các phân tử chống oxi hĩa cĩ nguồn gốc tự nhiên ngày càng tăng. Chúng thuộc lớp chitosan và một số dẫn xuất của chúng, an tồn và khơng độc hại cung cấp sự bảo vệ từ các gốc tự do, vì vậy làm chậm sự tiến triển của nhiều bệnh mãn tính. Được biết, tác động chống
oxi hĩa của chitosan khác nhau tùy vào trọng lượng phân tử và độ nhớt của chúng (Kamil, Jeon, & Shahidi, 2002) [17]. Xử lý mẫu cá trích với chitosan, tuy nhiên, cho thấy giá trị peroxide trong aldehyde dễ bay hơi thấp hơn mẫu khơng xử lý. Chitosan độ nhớt thấp cho thấy cĩ hiệu lực chống oxi hĩa mạnh nhất. Oligochitosan (Mw 1.3 và 3.5 kDa) ngăn chặn oxy hĩa trong chuột .
Kanatt (2008) cũng sử dụng dẫn suất chitosan gắn glucose bằng phản ứng Maillard trong bảo quản thực phẩm. Kết quả cho thấy phức hợp chitosan- glucose (GCC: glucose chitosan complex) vừa cĩ hoạt tính kháng khuẩn lại vừa cĩ hoạt tính chống oxy hĩa và đây là một phức hợp hứa hẹn làm chất bảo quản thực phẩm [18].
2.3.4.Màng phủ làm lành vết thương (would healing)
Chữa các vết thương là một quá trình thúc đẩy nhanh chĩng sự phục hồi da và làm nhanh sự lành vết thương. Một màng chitosan cĩ cấu trúc xốp được thiết kế cho màng phủ chữa vết bỏng, vết thương. Màng chitosan cĩ tác dụng kiểm sốt mất nước do bay hơi, đảm bảo trao đổi oxy cho da hơ hấp và thúc đẩy khả năng thốt chất lỏng. Ngồi ra nhờ hoạt tính kháng khuẩn tự nhiên của chitosan nên màng phủ chitosan cĩ hiệu quả hạn chế sự xâm nhiễm các vi sinh vật ngoại lai. Vết thương được bao phủ bởi màng chitosan cĩ tác dụng cầm máu và làm lành vết thương nhanh chĩng. Thí nghiệm về mơ bệnh học đã xác nhận sự tăng tỷ lệ phủ đầy biểu mơ cũng như tổ chức collagen dưới lớp biểu bì. Vết thương chữa chitosan giảm sẹo do ức chế các sự hình thành sợi trong vết thương và nĩ được cầm máu và hình thành lớp film bao phủ bảo vệ. Là một cơ chất cho lysozyme, sản phẩm phân hủy chitosan được hấp thu bên trong tế bào cĩ tác dụng làm tăng hoạt tính đại thực bào macrophage.
Phức hợp Chitosan-alginate dạng màng cũng cho thấy khả năng lành vết thương rất tốt. Hai dạng màng chitosan: Chit-LA và Chit –A A cho hiệu quả tốt trong điều trị vết thương. Kết quả cho thấy vết thương lành hồn tồn và khơng hình thành sẹo. Màng phối hợp giữa chitosan và cellulose cũng là một vật liệu chữa vết thương hiệu quả với đặc tính kháng khuẩn cao. Chúng cĩ thể bảo vệ vết thương nhờ khả năng khử nước và chống nhiễm trùng .
2.3.5.Sử dụng trong cấy ghép răng
Trong giải phẫu cấy ghép răng, quá trình phục hồi xương sử dụng vật liệu ghép vào xương đã trở nên cần thiết. Đối với thiết kế tái sinh tế bào xương, một loạt các polymer chống đỡ như chất nền collagen loại-1, chất nền xốp poly-(lactide/gylcolide)/ hydroxyapatite 3-D polymer, chitosan đã được tổng hợp. Các kết quả cho thấy sự tạo ra xương nhân tạo sử dụng kỹ thuật mơ hình mơ là một triển vọng để phục hồi mơ xương. Lee (2002) kết quả một thử nghiệm sơ lược in vitro đề nghị rằng chitosan cĩ tiềm năng biệt hĩa tế bào gốc tủy xương và thuận lợi hình thành xương[24]. Chitosan-tricalcium phosphat xốp cũng hứa hẹn là một vật liệu chống đỡ rất tốt cho cấy ghép vào các vị trí phục hồi xương in vivo.
2.3.6. Ứng dụng trong ly giải chậm thuốc
Hojo (2000) cơng bố gắn pentapeptide Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg cĩ hoạt tính kháng tế bào ung thư lên chitosan đã hạn chế khả năng bị phân hủy bởi enzyme tế bào thơng qua cầu trung gian carbodiimide. Nghiên cứu tạo phức hợp chitosan-(Gly)-Ala-Arg-Ser-Gly-Ile-Tyr-Ac, cho thấy hoạt tính ức chế rõ rệt trong thử nghiệm trên tế bào khối u phổi ác tính di căn B16-BL6 ở chuột. Kết quả này cao hơn so với pentapeptide nguyên thủy YIGSR. Hoạt tính chống khối u được tăng cường là nhờ phức hợp chitosan –petapeptide đã bảo vệ chống lại sự thủy phân của enzyme in vivo.
Shabori (2002) nghiên cứu chế tạo hạt nano chitosan để cố định thuốc cyclosporin A để uống, kích thước hạt nano là 150nm. Kết quả cho thấy hiệu suất mang thuốc là 94%, nồng độ cyclosporin A trong máu là 2760 ng/ml cao gấp 2.5 lần so với sodium glycolate nanoparticles. Hoạt tính của cyclosporin A cố định trong hạt nano chitosan tăng 72%, gelatin nanochitosan chỉ tăng 18%, riêng sodium glycholate lại giảm tới 36% so với đối chứng [10].
Xinge Zhang (2008) cơng bố nghiên cứu làm tăng khả năng hấp thu insulin qua niêm mạc mũi bằng hạt nano chitosan và PEG-hạt nano chitosan, kích thước hạt nano là 150-300 nm. Hiệu quả hấp thu insulin qua niêm mạc mũi thỏ ở mẫu PEG-hạt nano chitosan cao hơn so với PEG-chitosan là 30- 40%. Kích thước hạt nano càng nhỏ, diện tích bề mặt càng lớn và điện tích dương trên bề mặt càng cao là nguyên nhân ảnh hưởng đến khả năng hấp thu insulin vào máu qua niêm mạc mũi [52].
Shedaghi (2008) nghiên cứu chế tạo trimethyl hạt nano chitosan để làm vật liệu ly giải chậm insulin. Kết quả cho thấy động học ly giải của insulin nhốt trong trimethyl hạt nano chitosan ổn định và kéo dài hơn [45].
Shadeghi (2008) nghiên cứu hấp phụ insulin trên vật liệu nano chitosan, diethylmethyl nano chitosan nanoparticles (DEMC) và trimethylchitosan nanoparticles (TMC). Kết quả về động học ly giải chậm insulin khá ổn định cho cả ba vật liệu nanoparticle [45].
2.3.7. Hoạt tính kháng khuẩn
Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và các dẫn xuất của nĩ đã nhận được sự quan tâm đáng kể trong những năm gần đây. Cơ chế kháng khuẩn của chitosan là nhờ một số cơ chế sau:
- Chitosan là một polycationic, chúng tương tác với thành phần polyanion vách tế bào (lipopolysaccharides và protein) của vi sinh vật, kết
quả là sự rị rỉ thành phần nội bào do các thay đổi trong tính thấm của hàng rào (barrier); ngăn cản chất dinh dưỡng đi vào tế bào; ngăn cản sự nhập vào tế bào (đặc biệt là chitosan cĩ khối lượng phân tử thấp LMWC ).
- Chitoan cĩ khả năng kết hợp với DNA và nhờ vậy chitosan cĩ khả năng ức chế tổng hợp RNA và protein.
- Chitosan cĩ khả năng gắn kết gây đơng tụ, kết tủa tế bào vi khuẩn và dẫn đến giết chết tế bào.
Cơ chế tác động của chitosan và chitosan oligomer đối với E. coli và S.
aureus được Eaton (2008) nghiên cứu bằng kính hiển vi AFM (atomic force
microscope) như hình chụp dưới đây. Kết quả thấy rằng sau 24h xử lý, tế bào bị phá vỡ màng và thẩm thấu dịch tế bào ra ngồi mơi trường [7].
Hình 2.7. Ảnh hưởng của chitosan và chitosan oligomer (COS) đến tế bào E.coli (Eaton, 2008) E.coli (Eaton, 2008)
Tharanathan(2004)[Chitosan cho thấy một phổ kháng khuẩn rộng kháng lại cả nấm và vi khuẩn Gram dương và Gram âm [9].
Hong Kyoon No (2002) nghiên cứu ảnh hưởng của sáu loại khối lượng phân tử khác nhau của chitosan, chitosan oligomer đến khả năng kháng khuẩn trên 7 loại vi khuẩn gram dương và 4 vi khuẩn gram âm. Kết quả thấy rằng chitosan cĩ khối lượng phân tử cao cĩ khả năng kháng khuẩn tốt hơn chitosan oligomer cĩ khối lượng phân tử thấp hơn. Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan
mạnh hơn ở vi khuẩn gram âm hơn là vi khuẩn gram dương. Chỉ số MIC của chitosan biến động trong khoảng 0.05-0.1% tùy thuộc vào khối lượng phân tử và loại vi khuẩn. Hong Kyoon No cũng khẳng định rằng hoạt tính kháng khuẩn của chitosan thể hiện tốt hơn ở mơi trường pH thấp [12].
Nguyễn Anh Dũng (2004) cũng nghiên cứu khả năng kháng E.coli của chitosan, chitosan oligomer và chitosan oligomer cải biến bằng cách gắn với salicylic aldehyde đã làm gia tăng hoạt tính kháng khuẩn lên nhiều lần. MIC của chitosan đối với E. coli khoảng 250 ppm, oligoglucosamine khoảng 80- 100 ppm và salicyden oligoglucosamine (SO) chỉ cịn 30-40 ppm [3]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Muối ammonium bậc bốn của chitosan thể hiện hoạt tính kháng khuẩn rất cao. Ví dụ: diethylmethylchitosan cloride thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cao hơn chitosan. Hydroxypropyl chitosan ghép với acid maleic natri ức chế hơn 99% vi khuẩn Staphylococcus aureus và E. coli trong 30 phút tiếp xúc với nồng độ 100 ng/ml.
Avadi (2004) nghiên cứu chế tạo dẫn suất diethylmethylchitosan (DEMC) để tăng khả năng hịa tan trong dung mơi, nước và tăng tính kháng khuẩn gấp hai lần so với chitosan khơng cải biến (bảng 2.5) [6].
Nguyen Anh Dzung, Phạm Quang Anh, Pham Anh Hong (2007) nghiên cứu cải biến chitosan bằng cách gắn tạo nhánh chitosan với gốc đường glucose, glucosamine, trimethyl chitosan để tăng hoạt tính kháng khuẩn. Kết quả ghi nhận trong bảng 2.6 [38].
Bảng 2.4. Chỉ số MIC (µg/ml) và MBC (µg/ml) của chitosan và DEMC
Mơi trường Kiểm chứng (mẫu
trắng)
Chitosan DEMC
MIC MBC MIC MBC MIC MBC
Nước cất - - - - 500 500 AcOH 0,25% khối lượng 2500 2500 250 250 125 125 AcOH 0,5% khối lượng 2500 2500 225 225 110 110 AcOH 0,75% khối lượng 1250 1250 158 158 87,5 87,5 AcOH 1,00% khối lượng 1250 1250 125 125 62,5 62,5
Bảng 2.5. Chỉ số MIC của một số dẫn suất chitosan trên một số vi khuẩn
Các dẫn suất
MIC (ppm)
MSSA MRSA E. faecalis E. coli P.