Cây cẩm chướng được nhân giống bằng phương pháp hữu tính hoặc vô tính.
1.2.4.1 Nhân giống hữu tính
Chọn những cây khỏe, có hoa đẹp, không sâu bệnh, màu hoa tươi, sặc sỡ, hoa to. Cây để lấy hạt làm giống không nên cắt hoa, chỉđể giống ở cây chính vụ. Hạt hoa khó nảy mầm, phải bảo quản tốt hạt giống.
Đất làm kỹ, mịn, luống phẳng (rộng 80cm), xử lý Foocmalin (hay Foocmol) 40%, 5 cc foocmalin 40% cho 3 – 5 lít nước phun ướt đất, đậy nilon ủ 7 – 10 ngày.
Phân bón: 10kg phân chuồng mục, 1kg Tecmo phosphate, 1kg vôi bột, 0,5kg kali sunphat, trộn đều, rải trên đất, xới nhẹ để trộn. Có thể rạch hàng nông hay gieo trên mặt luống, nếu rạch hàng cách nhau 5 –10cm, hạt trước khi gieo trộn với tro hay cát rắc cho đều. Hạt rắc xong phủ 1 lớp đất bột mỏng, phủ một lớp rơm rạ mỏng, sau khi gieo 4 – 6 ngày, hạt sẽ mọc, tưới nhẹđủẩm 2 lần trong 1 ngày.
Khi cây gieo cao 2- 3cm, nhổ tỉa trồng thưa trên các luống vườn ươm với khoảng cách 5 x 5cm, cây được 10 – 12 cm thì đưa trồng nơi cốđịnh ngoài ruộng sản xuất. Hoa có thể trồng mùa hè, nhưng hoa xấu, thời vụ chủ yếu là đông xuân, để cho hoa vào ngày tết thường gieo hạt khoảng tháng 8 – 9 như các giống hoa khác.
Cây non ươm 25 – 27 ngày rồi mới trồng ra ruộng mật độ 25 x 30cm.
1.2.4.2 Nhân giống vô tính
Đối với nhân giống vô tính thì người ta nhân giống bằng cách giâm cành hoặc nuôi cấy mô. Giâm cành với thiết bịđơn giản, thời gian ngắn, dễ làm, giá thành thấp. Nhưng nếu giâm cành liên tục dễ dẫn đến thoái hóa giống, sản lượng thấp, phẩm chất kém. Nuôi cấy mô có hệ số nhân giống cao, cây sạch bệnh, sinh rưởng mạnh, chống chịu tốt, sản lượng cao, nhưng đòi hỏi thiết bị hiện đại, kĩ thuật, thời gian và chi phí.
v Nhân giống bằng ngọn
Thường nhân giống bằng hạt nhưng vì nhập hạt quá đắt nên người ta phải giâm bằng chồi và ngọn. Bằng phương pháp này chúng ta chủ động thời vụ, lượng
mẹ, tiến hành giâm từ tháng 8. Ta chọn cây mẹ F1 sinh trưởng khỏe, ngắt ngọn, vạt bớt lá già lá bánh tẻ, xử lý NAA, cắm vào cát ẩm trong nhà giâm cành (có giàn che).
Tiến hành: Đóng cọc quanh luống (rộng 1,2 – 1,5m), đổ đất phù sa lên, đổ
10cm cát sạch, phải làm luống cao 20 – 30cm, xử lý foomalin nồng độ 2 – 3% 10 ngày trước khi giâm cành. Cắm cách 2 – 3cm/1 cây, hàng ngày phun ẩm. Khoảng 10 – 15 ngày sau thì ra rễ. Khi có 90% số cây ra rễ thì mở giàn che, giàn có thể mở từ
từ, sau khi mở giàn phải phun thuốc trừ nấm ngay. Thời kỳ đầu không tưới nước phân, dùng phương pháp phun N:P:K (1:1:1), 5 ngày phun 1 lần, lần thứ 3 là 3%.
Mật độ trồng với khoảng cách 30 x 30cm. Sau khi trồng, ở mỗi gốc cây cắm 1 que nhỏ, rồi buộc nhẹ cây vào que để bảo vệ. Sau khi trồng ta tưới nước phân chuồng loãng tỷ lệ 1/200; lượng N:P:K (1:1:1), tưới nhiều lần trong ngày tới khi cây ra nụ.
Khi cây ra nụ, bón N:P:K (1:2:3) dạng phân là urê, tecmophotphat, K2SO4. Nếu cần ngắt ngọn để nhân giống, bón N:P:K (1:3:2). Cẩm chướng trồng bằng ngọn sau 70 – 85 ngày bắt đầu ra hoa. Cẩm chướng thơm hay bị bệnh đốm, lở cổ rễ do vi khuẩn gây nên, nên phải xử lý đất bằng Falizan… và phun Bactoudes khi phát bệnh.
v Nhân giống bằng nuôi cấy mô
Nhân giống cẩm chướng bằng nuôi cấy mô là phương pháp khoa học hiện đại, phục vụ cho nghiên cứu và cho sản xuất với qui mô công nghiệp. Ưu điểm là hệ số
nhân giống cao, cây sạch bệnh, chất lượng tương đối đồng đều, đồng nhất về mặt di truyền, cho hiệu quả trồng hoa tăng 150 – 200% so với phương pháp thông thường.
•Nuôi cấy mô sẹo
Các mô thường được sử dụng để tạo sẹo là: lá, thân, hoa, bao phấn, trái cây, hột, vùng chồi ngọn và rễ. Mô sẹo là khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản phân hóa của các tế bào đã phân hóa trong những điều kiện đặc biệt (vết thương, xử lý các chất điều hòa sinh trưởng thực vật...). Sự phản phân hóa cho phép một tế bào đã trưởng thành trở lại trạng thái trẻ hóa, giúp tế bào tái lập khả năng phân chia và tạo phôi soma trong điều kiện thích hợp (Pierik, 1987).
như cây mẹ. Từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên, mức độ biến dị tế bào soma lại cao hơn.
Tái sinh chồi mục đích là tái sinh định hướng các mô nuôi cấy. Tùy từng loại mô và giai đoạn nhân giống mà bổ sung vào môi trường MS (Murashige và Skoog,1962) thuốc điều hòa tăng trưởng theo tỷ lệ khác nhau (dao động từ 1 – 2ppm
đối với cytokinin và 0.5 – 1.0ppm đối với auxin).
Nhóm auxin gồm IAA; IBA; NAA; 2,4-D; 2,4,5-T; 4-CPA…là chất điều hoà sinh trưởng được sử dụng trong nuôi cấy mô - tế bào thực vật. Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào. Auxin NAA (1-naphthaleneacetic) kết hợp chặt chẽ với các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy để kích thích sự
tăng trưởng của mô sẹo và điều hoà sự phát sinh hình thái, đặc biệt khi được kết hợp với cytokinin. Nhóm cytokinin gồm BA; TDZ(thidiazuron); CPPU… cần thiết cho sự phân chia tế bào của mẫu cấy. Trong nuôi cấy mô, nếu lượng cytokinin không đủ
thì sự phân chia của nhân tế bào sẽ bị chăn lại tại một giai đoạn trong chu trình tế
bào. TDZ– cytokinin tự nhiên (có tác dụng tốt hơn BA – cytokinin tổng hợp), được báo cáo có hoạt tính cytokinin vào năm 1982. [1, 10,11]
•Sự phát triển chồi bất định
Chồi hoặc rễ bất định có thể có nguồn gốc từ mô sẹo và mô sẹo được coi như
là thể trung gian giữa mẫu cấy và cây con. Số lượng cụm chồi/mô sẹo được tăng lên qua những lần phân cắt khi cấy chuyền.
•Sự ra rễ in vitro và điều kiện ra rễ
Trong giai đoạn nhân giống, chồi được cấy chuyền thành từng cụm. Trước khi chuyển chồi sang môi trường ra rễ, cụm phải được tách ra thành từng đơn vị riêng rẽ. Tuy nhiên, trong một số trường hợp đặc biệt, thì sự ra rễ xảy ra tốt hơn khi chuyển từng nhóm nhỏ gồm vài chồi sang môi trường ra rễ. Đây là giai đoạn mà các chồi (có chiều cao tùy từng loài thực vật) được chuyển sang môi trường cảm ứng ra rễđể trở
thành cây con hoàn chỉnh, có thể kéo dài 2 - 4tuần lễ, loại và dạng chất kích thích ra rễ phụ thuộc vào loài thực vật. Gần đây, người ta có khuynh hướng cho chồi ra rễ
•Giai đoạn ra rễ in vivo
Khi được chuyển khỏi bình nuôi cấy, chồi được cấy vào một hỗn hợp cơ chất
ẩm giúp cho sự ra rễ. Hỗn hợp cơ chất có thể là than bùn, vỏ cây, khoáng chất, đá nhỏ, đá bọt, cát, đất, có thể trộn thêm một lượng nhỏ phân bón. Ghi nhận những loại cơ chất thích hợp cho sự ra rễ của từng loại thực vật. Than bùn có thể quá acid với một số loài xác định trong khi khoáng có thể quá kiềm. Môi trường lí tưởng cho sự ra rễ có pH trung tính hoặc hơi acid, có khả năng giữ nước nhưng lại phải thông thoáng.
•Các bước tiến hành nuôi cấy mô cẩm chướng
Chọn mẫu: cây lấy mẫu khỏe, sinh trưởng mạnh, không nhiễm sâu bệnh, mang đủ các đặc tính di truyền của giống.
Tái sinh chồi: Tiến hành trong phòng thí nghiệm. Tùy loại mô mà bổ sung vào môi trường MS (Murashige và Skoog,1962) thuốc điều hòa tăng trưởng theo tỷ lệ
khác nhau (khoảng 1 – 2ppm đối với cytokinin và 0.5 – 1.0ppm đối với auxin).
Khử trùng mẫu: Nguyên liệu khử trùng cho cẩm chướng là HgCl2 0.1% trong 10 phút hoặc CaOCl2 5 – 7% trong 15 – 20 phút, sau khi khử trùng 3 – 5 lần thì cắt nhỏ mẫu theo kích thước hợp rồi cấy lên môi trường tái sinh chồi.
Nhân nhanh cụm chồi: Cụm chồi sau khi được tái sinh từ giai đoạn tái sinh chồi, được cấy vào môi trường có bổ sung gibberellin acid viết tắt là GA3 (100 – 200ppm), qua đó kích thích khả năng phát sinh chồi bất định của cụm chồi.
Tạo cây hoàn chỉnh: Tiến hành trong phòng thí nghiệm. Để tạo cây hoàn chỉnh, cấy chuyền các chồi đơn lẻ hoặc đoạn vào môi trường ra rễ (than hoạt tính 0.3 – 0.5g/l, NAA 5 – 10ppm/l). Thông thường sau 2 tuần, mẫu nuôi cấy sẽ có từ 2 – 6 rễ, và chiều dài trung bình từ 2 – 3cm. Lúc này rễđạt tiêu chuẩn ra vườn ươm.
Chuyển cây ra vườn ươm: Tiến hành trong nhà lưới, là giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ phòng nuôi cấy ra vườn ươm, giá thể là 90% trấu hun cộng với 10% đất phù sa, cường độ ánh sáng 800 – 1200lux, nhiệt độ 21 – 280C,độẩm không khí 80 – 85%. Bổ sung khoáng N:P:K (tỷ lệ 1:1:1) nồng độ 0.1% cho cây bằng cách hòa vào nước và sử dụng hệ thống phun mù tự động để phun cho cây, 3 ngày phun dinh dưỡng 1
CHƯƠNG 2
2.1. Vật liệu 2.1.1. Cẩm chướng
Giống cẩm chướng Dianthus caryophylus L. sử dụng trong thí nghệm được cung cấp bởi Công ty bảo vệ giống thực vật (địa chỉ: 20C Phan Đăng Lưu).
Hạt cây cẩm chướng được dùng trong thí nghiệm khử trùng hạt. Tử diệp của cây cẩm chướng in vitrođược dùng trong thí nghiệm thử nghiệm môi trường tái sinh, thử nồng độ hygromycin và chuyển gen.
Hình 2.1: Hoa cẩm chướng Hình 2.2: Hạt cẩm chướng (Dianthus caryophylus L.)
2.1.2. Chủng vi khuẩn A.tumefaciens LBA 4404 có chứa plasmid pVDH396 tái tổ hợp
Chủng A. tumefaciens LBA 4404 được cung cấp bởi phòng Công Nghệ Gen, Viện Sinh Học Nhiệt Đới. Vi khuẩn A. tumefaciens LBA 4404 chứa plasmid pVDH396 có kích thước 15890 bp được sử dụng trong thí nghiệm chuyển gen vào tử
diệp cẩm chướng.
Hình 2.4: Sơđồ plasmid pVDH396 mang gen chọn lọc kháng hygromycin (gen
hpt), gen gusA và gen ipt
Hình 2.5: Gen hpt, gen ipt, gen gusA trongvùng T-DNA của plasmid pVDH396
Gen ipt: promoter pSAG12, terminater Tnos. Gen hpt: promoter CaMV35S, terminater T35S. Gen gusA: promoter CaMV35S, terminater T35S.
Vùng T-DNA của plasmid pVDH396 mang gen chọn lọc kháng hygromycin –
gen hpt (sinh tổng hợp enzyme hygromycin phosphotransferase), gen gusA (sinh tổng hợp enzyme β-glucuronidase) và gen ipt (gen isopentenyl transferase sinh tổng hợp cytokinin). Vùng ngoài T-DNA mang gen KanR (tạo ra enzyme kanamycine phosphotransferase) có tác dụng kháng kháng sinh kanaycin dùng để chọn lọc vi khuẩn A. tumefaciens mang plasmid pVDH396.
2.1.3. Môi trường và hóa chất sử dụng
v Hóa chất khử trùng: Javel nồng độ 1.5%, 3.0%, 5.0%
v Chất điều hòa tăng trưởng thực vật: NAA (1-naphthaleneacetic) và TDZ (thidiazuron).
v Hóa chất dùng trong chuyển gen:
•Acetosyringone tan trong cồn, pha trong nước cất, lọc vô trùng,
•Cefotaxime tan trong nước cất, lọc vô trùng, có tính diệt vi khuẩn.
•Hygromycin - là loại kháng sinh phổ biến aminoglycosidic, không bền với
điều kiện bên ngoài, bị phân hủy bởi ánh sáng và nhiệt độ. Vì thế, quá trình chọn lọc hygromycin chỉ diễn ra từ 2-3 tuần. sau đó cần thay mới môi trường.
v Môi trường MS (Murashige và Skoog,1962) (phụ lục 1)
v Môi trường B5 (phụ lục 1)
v Môi trường khảo sát sự tái sinh từ lá cẩm chướng:
10 môi trường tiến hành khảo sát sự tái sinh từ lá cẩm chướng là TS0 (đối chứng), TS1, TS2, TS3, TS4, TS5, TS6, TS7,TS8, TS9, TS10. Môi trường MSB5 là môi trường MS có thay vitamin môi trường MS bằng vitamin môi trường B5.
•TS0: MSB5 + 0.0 mg/l TDZ + 0.0 mg/l NAA (môi trường đối chứng).
•TS1: MSB5 + 0.0 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA
•TS2: MSB5 + 0.5 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA
•TS4: MSB5 + 1.5 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA •TS5: MSB5 + 2.0 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA •TS6: MSB5 + 0.0 mg/l TDZ + 0.2 mg/l NAA •TS7: MSB5 + 0.5 mg/l TDZ + 0.2 mg/l NAA •TS8: MSB5 + 1.0 mg/l TDZ + 0.2 mg/l NAA •TS9: MSB5 + 1.5 mg/l TDZ + 0.2 mg/l NAA •TS10: MSB5 + 20 mg/l TDZ + 0.2 mg/l NAA
v Môi trường khảo sát nồng độ chất chọn lọc: môi trường tái sinh TS3 có bổ
sung thêm hygromycin với nồng độ lần lượt là 0, 4, 8, 12, 16, 20 mg/l.
•KS0: MSB5 + 1.0 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA + 0 mg/l hygromycin (môi trường đối chứng) •KS1: MSB5 + 1.0 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA + 4 mg/l hygromycin. •KS2: MSB5 + 1.0 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA + 8 mg/l hygromycin. •KS3: MSB5 + 1.0 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA + 12 mg/l hygromycin. •KS4: MSB5 + 1.0 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA + 16 mg/l hygromycin. •KS5: MSB5 + 1.0 mg/l TDZ + 0.1 mg/l NAA + 20 mg/l hygromycin.
v Môi trường chọn lọc cây chuyển gen: môi trường tái sinh có bổ sung thêm 500µl/l cefotaxime, hygromycin với nồng độ lần lượt là 4 mg/l. , 8 mg/l., 12 mg/l.
v Môi trường LB (phụ lục1) bổ sung kháng sinh kanamycin nồng độ 50 mg/l dùng để chọn lọc và giữ dòng A. tumefaciens mang plasmid tái tổ hợp.
2.1.4. Điều kiện thí nghiệm
Tiến hành tại phòng thí nghiệm Công nghệ gen, Viện Sinh học Nhiệt đới. Nhiệt độ 25 ± 1oC. Chiếu sáng bằng đèn neon 16 giờ/ngày.
2.2. Sơđồ qui trình và nội dung nghiên cứu
Hình 2.6: Sơđồ qui trình tạo cây cẩm chướng chuyển gen.
Thuyết minh qui trình
v Tạo cây cẩm chướng in vitro: khử trùng hạt bằng javel, nuôi cấy cây cẩm chướng trên môi trường MSB5.
v Vector A. tumefaciens mang plasmid pVDH396 tái tổ hợp được cung cấp bởi Viện Sinh học Nhiệt đới.
v Khảo sát môi trường tái sinh: tìm môi trường thích hợp để hiệu suất tái sinh cây từ lá là cao nhất.
v Khảo sát nồng độ hygromycin: tìm nồng độ hygromycin thích hợp để chọn lọc Môi trường tái sinh
Chuyển gen
Chọn lọc trên môi trường tái sinh chứa hygromycin
Biểu hiện tạm thời (nhuộm GUS) Khử trùng Nuôi cấy invitro Mẫu lá Hạt cẩm chướng Vector A.tumefaciens mang plasmid pVDH396 tái tổ hợp Kết quả biểu hiện gen tạm thời Cây chuyển gen
Khảo sát môi trường tái sinh
Khảo sát nồng độ
v Chuyển gen bằng cách bắn sóng tạo vết thương trên mô lá, lắc mô lá cùng vi khuẩn chung với nhau trong môi trường MS lỏng, hút chân không để loại hết bọt khí, tiếp tục lắc mô lá cùng vi khuẩn chung với nhau trong môi trường MS lỏng khoảng 1 giờ 30 phút, ủ vi khuẩn và mô lá trên môi trường tái sinh trong 6 ngày.
v Kiểm tra biểu hiện sự có mặt của gen chuyển trong mô lá bằng phương pháp nhuộm GUS.
v Chọn lọc mô lá mang gen chuyển trên môi trường tái sinh chứa nồng độ
hygromycin thích hợp.
v Cây chuyển gen là cây phát triển từ những mô đã tái sinh chồi và còn sống sau quá trình chọn lọc (để xác định rõ cần kiểm tra bằng các phương pháp sinh học phân tử như PCR hay điện di…).
2.3. Phương pháp nghiên cứu. 2.3.1. Phương pháp khử trùng hạt. 2.3.1. Phương pháp khử trùng hạt.
v Nguyên tắc
Dung dịch khử trùng phải bảo vệ được mô thực vật và thời gian khử trùng phải đảm bảo tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật.
v Mục tiêu
Thí nghiệm nhằm khảo sát nồng độ và thời gian khử trùng hạt cẩm chướng bằng Javel để tỉ lệ nảy mầm là cao nhất và cây phát triển tốt nhất.
v Tiến hành
Hình 2.7: Qui trình khử mẫu.
Tiến hành khử trùng mẫu theo qui trình trên, đặc biệt từ bước ngâm cồn 70 % (trong 1 – 2 phút) trởđi phải được thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
Khảo sát nồng độ Javel khử trùng ở 1,5%, 3,0%, 5%.
Khảo sát thời gian khử trùng ngâm hạt trong Javel 5 phút, 10 phút, 15 phút ở
mỗi nồng độ.
Hạt cẩm chướng sau khi khử trùng sẽđược cấy vào bình tam giác chứa môi trường MS. Thực hiện 8 mẫu/bình, 5 bình/nghiệm thức.