v Nguyên tắc
Gen gusA được tách từE. coli (Jelferson và cs, 1987) là gen mã hóa cho sinh tổng hợp β-glucuronidase. Dung dịch X-Gluc không màu dưới tác động của enzyme
v Mục tiêu
Nhuộm GUS giúp kiểm tra biểu hiện tạm thời của gen chuyển dựa vào sự
hiện diện của các đốm có màu chàm.
v Tiến hành
Sau quá trình chọn lọc bằng kháng sinh hygromycin, những mẫu mô sẹo còn sống (là những mẫu nghi ngờ được chuyển gen thành công), ta lấy một vài mẫu
để nhuộm GUS.
Chuẩn bị hóa chất dùng trong phản ứng nhuộm GUS:
§Stock X – Gluc 5 ml
§Dung dịch đệm NaPO4 (pH=7) 10 ml
§EDTA 0,25 ml (pH=7) 4 ml
§Triton 100x 10% 1 ml.
Sau khi mẫu được ngâm 5 phút trong cồn 70%, lấy mẫu ra và ủ mẫu trong thuốc thử GUS ở 370C trong 24 giờ. Rửa mẫu bằng dung dịch cồn 90% cho đến khi mất màu diệp lục và quan sát màu xanh chàm dưới kính hiển vi.
Đối với mẫu có biểu hiện mạnh, ta có thể nhận thấy ngay màu xanh đặc trưng sau khi ủ mẫu qua đêm mà không cần phải rửa bỏ diệp lục tố.
Nhuộm gus là phương pháp không bền vững vì:
•Gen tổng hợp enzyme glucoronidase được chèn vào đoạn genome của protocorm, nhưng gen đích (gen cần chuyển) thì không được chèn.
•Gen đích được chèn, nhưng nằm ở trạng thái im lặng qua giai đoạn phiên mã và dịch mã, nên không biểu hiện.
•Có trường hợp, gen đích được chuyển và được phiên mã và dịch mã, nhưng gen GUS bị lặn.
•Khi quá trình chọn lọc bằng hygromycin không loại bỏ hoàn toàn được thể