Phương pháp này dựa trên sự khám phá hoạt tính sinh học ở nhiệt độ cao của DNA polymerase được tìm thấy trong các sinh vật ưa nhiệt (vi khuẩn sống trong các suối nước nóng). Phần lớn các DNA polymerase chỉ làm việc ở nhiệt độ thấp. Nhưng
ở nhiệt độ thấp, DNA xoắn chặt vì vậy DNA polymerase không có nhiều khả năng làm biến tính phần lớn các phần của phân tử. Nhưng các polymerase chịu nhiệt này hoạt động ở nhiệt độ rất cao, có thể lên đến 100oC. Ở nhiệt độ này DNA (dạng thẳng) sẽ bị biến tính.
Có 3 giai đoạn chính trong một chu kỳ phản ứng PCR và chúng được lặp đi lặp lại nhiều lần (chu kỳ) (thường từ 25 đến 75 chu kỳ).
a. Giai đoạn biến tính (denaturation)
Trong giai đoạn này phân tử DNA mẫu bị biến tính ở nhiệt độ cao (thường là từ 94-95oC, lớn hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử) trong vòng 30 giây đến 1 phút,
tất cả các liên kết hydro giữa hai mạch của phân tử bị bẻ gãy và tạo thành các DNA sợi đơn.
b. Giai đoạn lai
Nhiệt độ được hạ thấp ( thường từ 40-70oC, thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của mồi được sử dụng khoảng từ 3-5oC) cho phép các mồi bám vào các phân tử DNA sợi
đơn, đánh dấu phần DNA cần được khuếch đại. Giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến một phút (còn được gọi là giai đoạn ủ).
Nếu nhiệt độ quá thấp thì các mồi sẽ gây nên nhiều lỗi và kết quả là sẽ tạo nên nhiều sản phẩm phụ. Nếu nhiệt độ quá cao thì phản ứng sẽ không có kết quả. Công thức để xác định nhiệt độ nóng chảy là Tm=4(G+C)+2(A+T).
c. Giai đoạn kéo dài
Nhiệt độđược tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase xúc tác tổng hợp DNA tốt nhất. Công việc của DNA polymerase là di chuyển dọc theo DNA sợi đơn và sử dụng nó làm khuôn để tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với DNA mẫu bằng cách kéo dài các phần đã được đánh dấu bởi các mồi. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào kích thước của DNA mẫu, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Ở giai đoạn này của chu kỳ cuối cùng, thời gian được tăng thêm vài phút để
các sợi DNA chưa được sao chép xong hoàn thành qúa trình tổng hợp.
Sau mỗi chu kỳ, số bản sao của DNA mẫu lại được tăng gấp đôi. Ðây là sự
nhân bản theo cấp số nhân. Như vậy cứ 1 phân tử DNA mẫu, sau phản ứng PCR với n chu kỳ sẽ tạo thành 2n bản sao phân tử DNA.
Các thành phần chủ yếu của phản ứng PCR : DNA mẫu, mồi đặc hiệu, enzyme chịu nhiệt (Tag-polymerase), các loại Nu, thành phần môi trường là nước tinh khiết, dung dịch đệm và ion Mg 2+.
Ưu điểm của phương pháp PCR là chỉ cần một thời gian ngắn đã cho một số
lượng DNA theo mong muốn.