tumefaciences kết hợp sóng siêu âm.
v Nguyên tắc
Sóng siêu âm tạo vết thương hay nói đúng hơn là các lỗ (kênh) trên mô lá, tăng khả năng chuyển T-DNA của các tế bào vi khuẩn vào tế bào thực vật, đồng thời vết thương thực vật tiết ra những hợp chất phenol đặc biệt kích thích T-DNA từ Ti plasmid của vi khuẩn A. tumefaciens tiết ra rồi chuyển vào cây để gắn bền vững với bộ gen (genome) của cây. Trong thí nghiệm này, chúng ta bổ sung thêm hoạt chất acetomyringone có tính năng tương tự như hợp chất mà cây tiết ra khi bị thương để
thúc đẩy quá trình chuyển T-DNA ra ngoài. Ngoài ra, như đã biết sóng siêu âm tạo vết thương bằng cách gia tăng các bóng khí, khi bóng khí vỡ tạo áp suất và nhiệt năng giúp phá vỡ màng tế bào, các bọt khí sót lại có thể che lắp các kênh, làm giảm hiệu suất chuyển gen. Để tránh trường hợp này, ta sử dụng phương pháp hút chân không để phá vỡ các bọt khí. Như vậy, các T-DNA có thể dễ dàng vào trong tế bào thực vật mà không bị cản trở.
v Mục tiêu
Chuyển gen vào mô lá cây hoa cẩm chướng bằng phương pháp A. tumefaciens
kết hợp sóng siêu âm.
v Tiến hành
•Lá cẩm chướng được cắt rời ra (kích thước khoảng 4 x 8mm). Sau đó đem cho vào môi trường MS lỏng có bổ sung acetosyringone với nồng độ 200mg/l, lắc nhẹ.
•Sau đó, cho 20ml môi trường LB chứa vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
vào trong bình chứa mẫu lá và acetosyringone.
•Đưa bình chứa các mẫu lá vào thiết bị bắn sóng tạo vết thương bằng sóng siêu âm 35kHz với thời gian bắn sóng là 30 giây.
•Đưa bình vào máy hút chân không trong 30 giây.
•Đem hỗn hợp này lắc khoảng 1 giờ với tốc độ 150 vòng/phút.
•Sau giai đoạn chuyển gen, mẫu lá được đem ra thấm bằng giấy thấm và cấy vào các bình tam giác chứa môi trường tái sinh TS3.
•Mẫu lá và vi khuẩn còn bám trên lá được đem ủ trong buồng tối ở 24.5 0C.
•Sau 6 ngày nuôi chung (số ngày ủ chung tùy thuộc vào tốc độ phát triển của vi khuẩn), mẫu lá được cấy chuyển qua môi trường chọn lọc chứa hydromycin có bổ sung thêm cefotaxime (nồng độ 500 mg/l) để diệt các vi khuẩn A. tumefaciens.