L ỜI MỞ ĐẦU
4.1.1. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy là yếu tố quan trọng cho nấm sinh trưởng và phát triển, nếu môi trường không tốt, nấm mọc yếu hoặc không mọc.
Trong quá trình nảy mầm để hình thành bào tử, nấm Metarhizium cần các
nguồn C, N. Sự phát triển của nấm phụ thuộc vào các chất ức chế khác nhau. Môi trường thích hợp nhất cho nấm phát triển là môi trường có chứa kitin làm nguồn
cacbon. Các nghiên cứu cho thấy, nếu bổ sung thêm chất kitin và glucoza trong quá trình nuôi cấy. Nấm Metarhizium sẽ thu được số lượng bào tử cao, vì thành phần kitin trong môi trường nuôi cấy là rất cần thiết đối với các loại nấm, giúp
hình thành và phát triển bào tử đính (conidiospore) và bào tử trần (blastoospore).
Ngoài nguồn Nitơ vô cơ ra, nấm Metarhizium còn sử dụng tốt nguồn hữu cơ như protein, peptone, các axit amin trong đó có axit glutamic là axit thích hợp cho
nấm phát triển. Các nguyên tố vi lượng như Zn2+, Mg2+ … có tác dụng kích thích
cho sự phát triển của nấm.
Tùy từng loại nấm Metarhizium mà nhà sản xuất lựa chọn môi trường
thích hợp để cho các loại nấm phát triển tốt, đạt chất lượng cao.
4.1.2 Nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ và độ ẩm đến quá trình phát triển
của nấm M. anisopliae
Nhiệt độ và độ ẩm là hai yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự phát
triển của nấm. Viện Bảo vệ thực vật (dẫn theo Nguyễn Văn Tuất, 2004) đã xác
định phạm vi nhiệt độ thích hợp cho nấm Metarhizium phát triển tốt, nằm trong khoảng 25 - 30⁰C, ẩm độ thích hợp trong phạm vi từ 80- 90%. Trên hoặc dưới
ngưỡng nhiệt, ẩm độ đó thì nấm sẽ phát triển yếu, khi nhiệt độ quá cao thì bào tử
dễ bị chết, hoặc không hình thành bào tử.
4.1.3. Ảnh hưởng của ánh sáng
Qua nhiều năm sản xuất vi nấm, Viện Bảo vệ thực vật (Nguyễn Văn Tuất,
2004) xác định nấm M. anisopliae phát triển tốt trong điều kiện ánh sáng yếu, chỉ
cần một lượng ánh sáng nhỏ trong ngày với thời gian 6-8 giờ cũng đủ cho nấm
phát triển tốt. Vì vậy, phòng nuôi cấy nấm phải che ánh sáng mặt trời để hạn chế
tia tử ngoại.
4.1.4. Ảnh hưởng của độ thoáng khí
Hầu hết các loại nấm côn trùng thuộc loại hiếu khí. Khi nấm phát triển chúng đòi hỏi điều kiện có hàm lượng oxy thích hợp trong cả biên độ rộng cũng
như trong dụng cụ nuôi cấy. Phạm Thị Thùy và cs (2010) cho biết, phạm vi thích
hợp cho các loài nấm phát triển là 0,3 - 0,7 m3 môi trường / m3 không khí. Nếu
sản xuất lớn, cần để độ dày bề mặt của nấm trên khay ray nia khoảng 10 - 15 cm trong phòng sản xuất có không gian thích hợp và điều kiện ẩm độ phù hợp.
4.1.5. Ảnh hưởng của hàm lượng nước
Nấm kí sinh côn trùng đòi hỏi hàm lượng nước thích hợp, nếu quá khô hoặc quá ẩm thì nấm đều phát triển không tốt. Tỷ lệ nước thích hợp trong môi trường để nấm phát triển tốt là 30 - 50%. (Phạm Thị Thùy, 2010).
4.1.6. Ảnh hưởng của pH
Phạm vi nấm kí sinh côn trùng sống ở pH từ 3,5 - 8,0. Tuy nhiên nấm ưa môi trường axit và phát triển thích hợp nhất ở pH từ 5,5 - 6. Vì vậy các tác giả
khuyến cáo bổ sung vào môi trường một lượng nhỏ KH2PO4 và MgSO4 và MgSO4.7H2O, mục đích là để duy trì tính ổn định của pH trong môi trường nuôi
cấy (Phạm Thị Thùy, 2010).
khối cao, chất lượng thuốc nấm ổn định và không có hiện tượng gây tạp nhiễm
(Nguyễn Văn Tuất, 2004; Phạm Thị Thùy, 2010).
4.2. Công nghệ sản xuất nấm Metarhizium spp [2, 4, 7, 8]
4.2.1. Sử dụng các chủng giống để sản xuất
Nguyễn Văn Tuất (2004), Phạm Thị Thùy (2010), cho biết một số nguồn
chủng giống có thể dùng để sản xuất chế phẩm nấm Metarhizium spp.
- Nấm Metarhizium anisopliae, chọn chủng nấm Metarhizium anisopliae
được phân lập trên rầy nâu, trên bọ hại dừa.
- Nấm Metarhizium flavoviride, chọn chủng Metarhizium flavoviride được
phân lập trên cào cào, châu chấu.
4.2.2. Chọn môi trường
a)Môi trường nhân giống cấp 1 (trên ống thạch):
Một số môi trường phổ biến đang được sử dụng rộng rãi ở Việt Nam (Theo
Nguyễn Văn Tuất, 2004; Phạm Thị Thùy, 2010)
Môi trường Crapek Dox
- Agar 20 g - Sacharoza 30 g - NaNO3 3 g - KH2PO4 1 g - MgSO4.7H2O 0,1 g - KCl 0,5 g - FeSO4 0,01g - H2O 1000 ml - pH 5,5
Môi trường Sabouraud
- Agar 20 g - Glucoza 40 g
- Pepton 10 g - H2O 1000 ml - pH 6
Môi trường Sabouroud khoáng chất ( PT.Thùy 1992) - Agar 20 g - Pepton 10 g - Glucoza 40 g - MgSO4. 7H2O 0,5 g - KH2PO4 1g - H2O 1000 ml - pH 6
b) Chọn môi trường nhân giống cấp 2
Phương pháp lên men chìm :
Môi trường cao nấm men (Rombach và Agula, 1988): - Cao nấm men 10 g - Pepton 15 g - KH2PO4 1 g - MgSO4. 7H2O 1g - Aga 20 g - H20 1000 ml - pH 6
Môi trường Sabouroud, Dextroza, Aga, cao nấm men ( SDAY)
- Cao nấm men 10 g - Pepton 15 g - Sacharoza 10 g - Aga 20 g
- pH = 6,5
Phương pháp lên men xốp:
Môi trường sản xuất:
- Bột cám gạo 50% - Bột ngô 30% - Bột đậu tương ( hoặc đậu xanh) 10% - Trấu ( hoặc bã mía, vỏ lạc) 10%
Năm 2003- 2004, Phạm Thị Thùy và cs đã nghiên cứu môi trường sản xuất
nấm M. anisopliae có thành phần 50% cám gạo, 20% bột ngô, 20% bột đậu, 10%
trấu với tỷ lệ nước/ môi trường sản xuất là 50%, cấy chủng nấm M. anisopliae
được phân lập trên bọ sữa Phú Quốc, chất lượng chế phẩm nấm đạt cao 3,0 x 1010 BT/g. Đây là kết quả rất tốt có triển vọng rút ngắn số lượng chế phẩm nấm để
phòng trừ sâu hại trên 1 ha cây trồng, nhằm giảm giá thành cho nông dân.
4.3. Phương pháp sản xuất [2, 4, 6, 7, 8]
4.3.1. Lên men chìm
Với phương pháp này giúp chúng ta dễ dàng thu nhận sinh khối bào tử,
tinh thể độc và các sản phẩm khác như chất kháng sinh, các độc tố ở dạng hòa tan
trong môi trường dinh dưỡng của Metarhizium anisopliae để diệt sâu bệnh. Ngoài
ra phương pháp này có ưu điểm là môi trường dinh dưỡng có thể đáp ứng hoàn toàn với nhu cầu sinh lí của Metarhizium anisopliae.
Do đó hiệu suất thu sản phẩm cao, tự động hóa trong công nghệ giúp giảm
nhân công và diện tích làm việc không quá lớn.
Các bước tạo chế phẩm từ Metarhizium anisopliae bằng con đường lên men chìm :
Bước 1: Chuẩn bị ống giống nuôi 5-7 ngày
Bước2 : Nhân giống trong bình 250ml có 100ml môi trường, lắc 200v/
Bước3:Nhân giống trong bình 1000ml môi trường. Lắc 200v/phút, ở nhiệt độ 28-30oC, nuôi 24 giờ .
Bước4: Lên men trong hệ thống tự động, khuấy 550v/phút, ở nhiệt độ 29 - 30oC nuôi trong 72 giờ.
Bước 5:Li tâm lạnh 3000v/phút trong 40 phút. Sau đó thu sinh khối và bổ
sung chất phụ gia.
Bước 6 : Sấy khô ở 30-35oC.
Sơ đồ làm rõ cho các bước
Sơ đồ 3.1. Sơ đồ lên men chìm được sản xuất tại một số cơ sở trong nước
Trong phương pháp lên men chìm ngoài việc sử dụng các nồi lên men
thông thường, người ta còn áp dụng nuôi cấy trong các đệm plastic trên quy mô công nghiệp khi áp dụng nuôi cấy chủng này để thu chế phẩm diệt sâu hại.
Khi áp dụng lên men chìm có thể gặp những hạn chế như trang thiết bị
phức tạp, kinh phí đầu tư cao, kĩ thuật công nghệ tiên tiến. Khi nuôi cấy
Metarhizium anisopliae chỉ thu được bào tử chồi, bào tử này có sức sống kém, thời gian sống ngắn, cấu trúc kém . Nhân giống Lên men Ly tâm Sấy Chế phẩm Giống
4.3.2. Lên men bề mặt không vô trùng
Trong điều kiện thiếu trang thiết bị hoàn chỉnh để lên men chìm, người ta
có thể sử dụng phương pháp lên men bề mặt không vô trùng để thu nhận chế
phẩm diệt côn trùng từ nấm, vi khuẩn.
Khâu khó khăn nhất trong quy trình này là hạn chế sự nhiễm tạp của vi
khuẩn lạ. Do môi trường không được hấp khử trùng. Để khắc phục ta có thể đun môi trường ở 100⁰C trong 30 phút, khi nguội cho thêm kháng sinh streptomycine 0.01%.
Các bước lên men bề mặt
Bước 1 : Nấm nuôi trong ống thạch nghiêng hay đĩa pertri 7-10 ngày ở
nhiệt độ 28 - 30 oC
Bước 2 : Lấy bào tử
Bước 3 : Cho vào các chậu thủy tinh lớn có lớp môi trường dịch 1 – 1,5 cm (chậu phải được sấy ở 100oC trong 30 phút, môi trường dịch nấu sôi ở 100oC trong 30 phút).
Bước 4 : Nuôi 12 ngày ở nhiệt độ 25 - 30oC.
Bước 5 : Vớt thảm nấm có bào tử, đồng thời cuốn tròn mặt bào tử ở trong.
Bước 6 : Thấm cho ráo nước và bổ sung chất phụ gia.
Bước 7 : Nghiền nhỏ bằng máy nghiền.
Bước 8 : Sấy khô ở 30 - 35oC.
Sơ đồ làm rõ cho các bước:
Sơ đồ 3.2. Sơ đồ lên men bề mặt không vô trùng
Nấm Lấy bào tử Vào chậu Nuôi Vớt thảm Nghiền Sấy Chế phẩm
Ngoài ra để đảm bảo được sự phát triển áp đảo của chủng vi sinh vật nuôi cấy, cần tuân thủ các nguyên tắc sau :
- Môi trường sau khi đun 100oC trong 30’, được để nguội và cấy bào tử
vào, số bào tử này sẽ khuếch tán thành một màng mỏng khắp bề mặt môi trường.
Trong thời gian nhất định chúng sẽ ngăn cản không cho không khí khuếch tán vào môi trường. Do vậy cũng làm hạn chế sự tạp nhiễm của các vi sinh vật lạ.
Lượng bào tử cấy vào đủ để áp đảo vi sinh vật lạ là 1- 2 tỉ bào tử/cm3
- pH của môi trường trong khoảng 5.0 - 5.5 thích hợp cho sự phát triển của
nấm, vi khuẩn.
4.3.3. Lên men xốp
Quy trình sản xuất nấm M.anisopliae của Ninh Thị Huyền Nga Trường
Nông Lâm Tp. HCM (2005).
Phương pháp này được sử dụng thành công để sản xuất nấm Metarhizium
và một số nấm diệt côn trùng khác. Trong quy trình lên men xốp này, tác giả sử
dụng các loại cơ chất khác nhau như bột đậu nành, bã đậu phụ, lúa, gạo cùng với
dịch dinh dưỡng nuôi cấy nấm Metarrhizium.
Quy trình được mô tả như sau: Bước 1: Chuẩn bị ống giống.
Bước 2: Cho vào môi trường xốp trong bình 250 ml, nuôi 4 - 5 ngày ở
nhiệt độ 28 -32⁰C.
Bước 3: Môi trường xốp trong chậu thủy tinh (khử trùng 100⁰C trong 40 phút) và bổ sung 10% giống, nuôi 10 ngày ở 28 - 32⁰C, độ ẩm tương đối 95%.
Bước 4: Làm khô ở nhiệt độ phòng có quạt, độ ẩm dưới 10% hoặc sấy ở
40oC.
Sơ đồ làm rõ cho các bước:
Sơ đồ 3.3. Quy trình lên men xốp
Ống giống 5 -7 ngày
Môi trường dịch thể, lắc
200 vòng/phút, nuôi tº= 28 - 30ºC
Môi trường xốp trong bình
250ml, nuôi 4 -5 ngày ở tº = 28 - 32ºC
Môi trường xốp trong chậu thủy tinh
( khử trùng 100ºC trong 30 – 40 phút) + 10% giống. Nuôi 10 ngày ở
tºC= 28- 32ºC.
Nghiền nhỏ. Đóng bao nhãn. Kiểm tra
chất lượng. Bảo quản ở 5 - 10ºC
Làm khô ở nhiệt độ phòng. Có quạt.
Công thức tính số lượng bào tử trong 1g bột nấm 4000x 1000x a x 10-n D= b D: số bào tử trong 1 g bột nấm a: số bào tử đếm được n: nồng độ pha loãng
b: số ô nhỏ nhất của buồng đếm hồng cầu
Quy trình lên men xốp của Viện Bảo vệ thực vật (Nguyễn Văn Tuất,
2004; Phạm Thị Thùy, 2010). Chọn chuẩn nấm:
- Sản xuất nấm Metarhizium flavoviride phải chọn chủng Metarhizium flavoviride được phân lập trên cào cào, châu chấu.
- Sản xuất nấm Metarhizium anisopliae chọn chuẩn Metarhizium anisopliae được phân lập trên rầy nâu hoặc trên bọ hại dừa.
- Chọn môi trường nhân giống cấp 1 và nhân giống cấp 2:
- Chuẩn bị các môi trường cấp 1 và cấp 2
- Môi trường cấp 1 khử trùng 0,8 at trong 30 phút.
- Môi trường cấp 2 và môi trường sản xuất lên men xốp phải khử trùng 1 at trong 30 phút. Cấy giống cấp 1 vào môi trường nhân giống và môi trường sản
Ống giống thuần
Môi trường nhân giống cấp 1
Môi trường nhân giống cấp 2
Rải ra nia để hình thành bảo tử trần (2 ngày)
Thu sinh khối, sấy 40- 45ºC trong 6-8 giờ
Hỗn hợp phụ gia để tạo chế phẩm nấm
Kiểm tra chất lượng bào tử nấm
Thử hoạt lực trên sâu
Đóng gói, bảo quản và sử dụng
Hình 3.4 . Quy trình sản xuất nấm Mat theo phương pháp lên men bề mặt
(xốp)
4.3.4. Tạo chế phẩm ở qui mô nhỏ - thủ công [2]
Bước 1: Chuẩn bị môi trường gạo nuôi cấy nấm: ngâm gạo với nước trong 1 - 1 giờ 30 phút (tùy theo gạo mềm cơm hay cứng cơm, rẻ nhất là sử dụng gạo
IR 50404), vớt gạo cho vào từng bọc nylon trung bình là 500 g/bọc, buộc kín
miệng bằng dây thun.
Bước 2 : Hấp khử trùng: cho nước ngập đến vỉ ngăn nước nồi nhôm rồi cho
từng bọc gạo nylon vào nồi, hấp thanh trùng khoảng 1 - 1 giờ 30 phút (kể từ nước sôi), đun bằng than đá hoặc củi. Vớt bọc gạo ra ngoài để nguội.
Bước 3 : Chủng nấm nguồn vào môi trường gạo: chia dĩa nấm Metarhizium anisopliae gốc thành 6 phần bằng nhau (1/6 để sử dụng 1 bọc gạo nylon), dùng dao rạch nấm gốc thành từng miếng nhỏ, rồi cấy vào một bọc gạo nylon, dùng co
ống nước làm miệng, đậy nắp gòn và bịt đầu môi trường. Đem ủ chế phẩm để nơi cao ráo thoáng mát trong điều kiện nhiệt độ từ 28 - 30 độ, lắc bọc chế phẩm một
lần/ngày, sau 10 - 14 ngày quan sát thấy nấm xanh bao phủ hết hạt gạo (hạt gạo
nhỏ dần), có thể sử dụng được hòa chế phẩm trong nước qua vải lược, mỗi bọc
cho 4 bình 16 lít (2 bình/1.000 m2), khi cho chế phẩm vào bình pha thêm 5cc chất bám dính, phun chậm vào gốc lúa và phun xịt lúc trời mát (dẫn theo Huỳnh
Thanh Bình 2003).
4.4. Cải tiến quy trình bảo quản giống gốc
4.4.1. Phục hồi giống gốc
Nâng cao hoạt tính diệt côn trùng của các chủng nấm đã có từ trước đây
bằng cách cấy truyền qua côn trùng rồi phân lập và thuần hóa lại để nâng cao
hoạt tính diệt côn trùng của các chủng nấm Metarhizium.
Kết quả thí nghiệm cho thấy rằng nếu nấm xanh được nuôi cấy và cấy
truyền qua 4 - 5 lần trên môi trường nhân tạo thì khả năng sinh trưởng phát triển
nó rồi phân lập và tạo thuần trở lại thì những đặc tính sinh học này của chúng được phục hồi trở lại. Vì vậy, các tác giả cho rằng sau 4- 5 thế hệ, cần phải phục
hồi giống gốc bằng cách cấy lại trên côn trùng ký chủ.
4.4.2. Các phương pháp bảo quản một số giống nấm côn trùng ở Việt Nam
Đến nay, Viện Bảo vệ thực vật bảo quản bộ giống nấm theo một số phương pháp sau:
a) Bảo quản truyền thống
Ở nhiệt độ phòng từ 1- 2 tuần tùy theo điều kiện nuôi cấy khác nhau, sau đó giữ trong lạnh ở nhiệt độ 5- 6ºC, cứ sau 2- 3 tháng cấy truyền lại. Phương pháp này này đơn giản nhưng tốn công, mặt khác giống bảo quản không được
lâu. Tuy nhiên phương pháp này hiện nay đang được áp dụng phổ biến vì thuận
lợi trong việc sử dụng giống để sản xuất kịp thời mỗi khi có dịch.
b) Bảo quản để trong tủ lạnh sâu