3.3.1 Dụng cụ - Erlen 500 ml (Duran). - Ống sinh hàn (Duran). - Phễu lọc. - Bình 3 cổ 250 ml (Duran). - Bơm chìm. - Cột C18-E (Phenomenex). 3.3.2. Hóa chất
- Dung môi trích ly: hexan, ethyl acetat, ethanol (Trung Quốc). - Chất ổn nhiệt : Glyxerin (Trung Quốc).
3.3.3. Thiết bị
- Hệ thống sắc kí khí – khối phổ (GC – MS)
- Hệ thốngsắc kí lỏng cao áp HPLC (Hitachi, Nhật). - Máy nghiền KiKa M20 (Teco, Đài Loan).
- Máy lọc chân không (LMW, Đức). - Bếp điện từ, cá từ (Heidolph MR3001K). - Lò vi sóng (Akira, Trung Quốc).
- Tủ sấy (Ketong, Đài Loan).
- Một số thiết bị, dụng cụ thí nghiệm thông thƣờng khác tại phòng thí nghiệm vật liệu vô cơ viện khoa học vật liệu ứng dụng thành phố Hồ Chí Minh.
3.4. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát ảnh hƣởng của loại dung môi đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt Neem
- Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và thời gian đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt Neem.
- Khảo sát ảnh hƣởng của việc hỗ trợ xử lý nguyên liệu bằng vi sóng đến hiệu suất trích ly limonoid từ hạt Neem.
3.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.5.1. Khảo sát ảnh hƣởng của loại dung môi đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt Neem limonoid từ hạt Neem
- Mục đích: Xác định loại dung môi thích hợp cho hiệu suất cao.
- Yếu tố khảo sát bao gồm: Dung môi trích ly gồm hexan, ethyl acetat, ethanol.
- Yếu tố cố định: tỷ lệ khối lƣợng nguyên liệu và thể tích dung môi là 1:5. Ở nhiệt độ 500
C; thời gian trích ly 3 giờ; kích cỡ nguyên liệu 0,425 – 0,71 mm [18].
- Cách thực hiện:
Nguyên liệu để tiến hành thí nghiệm là hạt Neem lấy ở huyện Ninh Phƣớc, tỉnh Ninh Thuận. Các nguyên liệu này đƣợc sấy khô ở 600C cho đến khi trọng lƣợng không đổi. Xay thành bột, bột nguyên liệu có độ ẩm 10-12%. Cân 50 g bột hạt Neem cho vào erlen 500 ml, thêm 250 ml dung môi vào erlen.
Bếp từ đƣợc gia nhiệt để đun dung dịch ổn nhiệt lên 500C (glixerin) sau đó cho erlen chứa bột hạt Neem và dung môi lên bếp đun ổn nhiệt có khuấy từ và gắn ống sinh hàn ở 500
C trong 3 giờ. Lắp hệ thống nhƣ hình 3.1
Hình 3.1 Thiết bị trích ly dầu Neem
Sau 3 giờ lấy erlen ra đem đi lọc chân không lấy dung dịch chiết. Dịch chiết đƣợc đem đi cô quay chân không để loại hoàn toàn và thu hồi dung môi, ta thu đƣợc cao sau khi trích ly. Đem cân số cao này bằng cân phân tích. Cao này đƣợc cho chạy qua cột C18 – E để tách cao chiết thành 2 pha với 2 dung môi lần lƣợt là n- hexan và methanol. Đem 2 dung dịch n-hexan và methanol thu đƣợc đem đi cô quay chân không để loại hoàn toàn dung môi. Thu đƣợc số gam chất chiết từ 2 dung môi này. Sau đó sẽ đƣợc đem đi phân tích trên hệ thống HPLC với pha động là ACN:H2O với tỉ lệ 60:40, tốc độ 0,6 phút, trong 10 phút ở bƣớc sóng 217nm. Khi đó peak azadirachtin ở 7,8 phút.
Phần bã Neem sau khi lọc đƣợc đem sấy ở 600C, đem phần bã này đi cân lại khối lƣợng để biết độ hao hụt khối lƣợng trƣớc và sau khi chiết.
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại nhằm chọn các nghiệm thức có hiệu suất thu hồi cao.
Sơ đồ 3.1 Quy trình trích ly hoạt chất limonoid từ hạt cây Neem Chiết với dung môi (2)
Lọc chân không
Chƣng cất dƣới áp suất chân không Bột nguyên liệu (1) (50g) Ly trích Hỗn hợp dầu neem và dung môi Cao trích ly Dung môi thu hồi Cột C18-E
Cô quay chân không
Rửa bằng n- hexan (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Rửa lại cột bằng methanol
Dung dịch methanol Lipit và một số chất phân cực yêú Cao Neem Dung dịch n hexan
Ghi chú:
(1)Sử dụng bột hạt Neem khô có độ ẩm 10 – 12%. (2)Trích ly lần lƣợt với hexan, ethyl acetat và ethanol.
3.5.2. Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và thời gian đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt Neem gian đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt Neem
Từ kết quả có đƣợc ở thí nghiệm 3.5.1 chọn đƣợc dung môi thích hợp. Đề tài sử dụng dung môi này để tiến hành thí nghiệm tiếp theo 3.5.2.
Mục đích: nhằm xác định khoảng thời gian và tỷ lệ nguyên liệu/dung môi thích hợp cho hiệu suất trích ly cao.
Cách thực hiện: nguyên liệu để tiến hành thí nghiệm là hạt Neem lấy ở huyện Ninh Phƣớc, tỉnh Ninh Thuận. Các nguyên liệu này đƣợc sấy khô ở 600
C cho đến khi trọng lƣợng không đổi. Xay thành bột, bột nguyên liệu có độ ẩm 10-12%. Cân 50(g) bột hạt Neem cho vào erlen 500 ml, thêm số ml dung môi đã xác định đƣợc ở thí nghiệm 3.5.1 vào erlen theo tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi (1:3; 1:5 và 1:7).
Bếp từ đƣợc gia nhiệt để đun dung dịch ổn nhiệt lên 500
C (glixerin). Sau đó cho erlen chứa bột hạt Neem và dung môi lên bếp đun ổn nhiệt có khuấy từ và gắn ống sinh hàn ở 500
C trong thời gian lần lƣợt là 3 giờ, 5 giờ và 7 giờ.
Sau khoảng thời gian thí nghiệm, lấy erlen ra đem đi lọc chân không lấy dung dịch chiết. Dịch chiết đƣợc đem đi cô quay chân không để loại hoàn toàn và thu hồi dung môi, ta thu đƣợc cao sau khi trích ly. Sau đó, cân số cao này bằng cân phân tích. Cao này đƣợc cho chạy qua cột C18 – E để tách cao chiết thành 2 pha với 2 dung môi lần lƣợt là n-hexan và methanol. Đem 2 dung dịch n-hexan và methanol thu đƣợc đem đi cô quay chân không để loại hoàn toàn dung môi. Ta thu đƣợc số gam chất chiết từ 2 dung môi này. Sau đó sẽ đƣợc đem đi phân tích trên hệ thống HPLC.
Phần bã Neem sau khi lọc đƣợc đem sấy ở 600C, đem phần bã này đi cân lại khối lƣợng để biết độ hao hụt khối lƣợng trƣớc và sau khi chiết.
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 yếu tố khảo sát ở nhiệt độ 500
C; tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi (1:3, 1:5 và 1:7) và khoảng thời gian (3 giờ, 5 giờ và 7 giờ).
Chỉ tiêu theo dõi bao gồm: Hiệu suất thu hồi hoạt chất limonoid.
3.5.3. Khảo sát ảnh hƣởng của việc hỗ trợ xử lý nguyên liệu bằng vi sóng đến hiệu suất trích ly limonoid từ hạt Neem sóng đến hiệu suất trích ly limonoid từ hạt Neem
Sau khi xác định đƣợc loại dung môi, tỉ lệ dung môi và nguyên liệu, và khoảng thời gian trích ly thích hợp thì tiến hành khảo sát sự ảnh hƣởng của việc hỗ trợ xử lý nguyên liệu bằng vi sóng đến hiệu suất trích ly limonoid từ hạt cây Neem.
Mục đích: xác định đƣợc khoảng thời gian xử lý vi sóng và công suất vi sóng cho hiệu suất trích ly limonoid cao.
Cách thực hiện: Cân 14,2 g bột hạt Neem cho vào bình cầu cổ nhám 250 ml, thêm 70 ml dung môi đã xác định đƣợc ở thí nghiệm 3.5.1 vào bình theo tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi đã xác định đƣợc ở thí nghiêm 3.5.2 trong khoảng thời gian xử lý vi sóng 10 và 15 phút. Thí nghiệm đƣợc tiến hành ở công suất vi sóng: 495 W, 630 W, 900 W [12].
Cho bình cầu chứa bột hạt Neem và dung môi vào lò vi sóng có khuấy từ, gắn ống sinh hàn và tiến hành thí nghiệm.
Các công đoạn tiếp theo tƣơng tự ở thí nghiệm 3.5.1 và 3.5.2.
Sau khoảng thời gian thí nghiệm, lấy bình cầu ra đem đi lọc chân không lấy dung dịch chiết. Dịch chiết đƣợc đem đi cô quay chân không để loại hoàn toàn và thu hồi dung môi, ta thu đƣợc cao sau khi trích ly. Đem cân số cao này bằng cân phân tích. Cao này đƣợc cho chạy qua cột C18 – E để tách cao chiết thành 2 pha với 2 dung môi lần lƣợt là n-hexan và methanol. Đem 2 dung dịch n-hexan và methanol thu đƣợc đem đi cô quay chân không để loại hoàn toàn dung môi. Ta thu đƣợc số gam chất chiết từ 2 dung môi này. Sau đó sẽ đƣợc đem đi phân tích trên hệ thống HPLC.
Hình 3.4 Thiết bị trích ly có hỗ trợ vi sóng
Phần bã Neem sau khi lọc đƣợc đem sấy ở 600C, đem phần bã này đi cân lại khối lƣợng để biết độ hao hụt khối lƣợng trƣớc và sau khi chiết.
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 yếu tố khảo sát ở công suất (495 W, 630 W, 900 W) và khoảng thời gian (10 và 15 phút)
Chƣơng 4
KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1. Khảo sát ảnh hƣởng của loại dung môi đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt Neem limonoid từ hạt Neem (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thí nghiệm đƣợc thực hiện nhƣ ở mục 3.5.1.
Lƣợng cao thu đƣợc từ phƣơng pháp trích ly bằng dung môi với 3 loại dung môi (hexan, ethyl acetate, etanol) khác nhau đƣợc ghi nhận ở bảng 4.1.
Bảng 4.1 Kết quả lƣợng cao Neem thu đƣợc bằng 3 loại dung môi khác nhau
Lƣợng cao Neem thu đƣợc (g)
Hexan Ethyl acetate Etanol
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trun g bình Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trun g bình Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trun g bình 0,75 0,71 0,5 0,65 0,82 0,8 0,72 0,78 2,3 2,1 1,7 2,03
Các loại dung môi hữu cơ có ảnh rất lớn đến hiệu suất trích ly các hợp chất thiên nhiên. Hiệu suất trích ly phụ thuộc rất nhiều vào độ phân cực của dung môi và độ phân cực của hợp chất cần tách. Phƣơng pháp trích ly các chất mang hoạt tính sinh học thƣờng đƣợc thực hiện ở nhiệt độ thấp, trong ngƣỡng cho phép của hợp chất cần tách. Hầu hết các chất có hoạt tính sinh học thƣờng dễ bị phá hủy bởi nhiệt.
Hình 4.1 Biểu đồ thể hiện khối lƣợng cao thu đƣợc từ 3 loại dung môi
Phân tích sắc kí lỏng cao áp (HPLC), đã xác định đƣợc hàm lƣợng limonoid trong cao Neem thu đƣợc. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.2
Bảng 4.2 Kết quả lƣợng limonoid thu đƣợc bằng 3 loại dung môi khác nhau
Lƣợng Limonoid thu đƣợc (mg)
Etanol (A2) Hexan (B2) Ethyl acetate (C2)
Hình 4.2 Cao Neem sau khi trích ly
Hình 4.2 Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng limonoid phụ thuộc vào loại dung môi
Trên cơ sở các số liệu về hàm lƣợng limonoid thu đƣợc trên 3 loại dung môi khác nhau, có thể thấy rằng dung môi etanol là dung môi trích ly đƣợc 130,67 mg (chiếm 0,26 %) limonoid nhiều nhất trong 3 loại dung môi. Hai dung môi n- hexan và ethyl acetate lần lƣợt là 18,98 và 36,83 mg, chủ yếu trích ly đƣợc dầu Neem, hàm lƣợng limonoid là không đáng kể. Theo Nguyễn Tiến Thắng và Vũ Văn Độ (
2005), hàm lƣợng limonoid tách bằng etanol là 3879,2 mg/kg hạt chiếm 0,35%. Vì vậy dung môi thích hợp cho việc trích ly limonoid từ hạt cây Neem là etanol rất phù hợp với những nghiên cứu trƣớc đó.
4.2. Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và thời gian đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt Neem hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt Neem
Từ kết quả có đƣợc ở thí nghiệm 3.5.1 chọn đƣợc dung môi etanol là dung môi thích hợp để tiến hành thí nghiệm tiếp theo 3.5.2. Kết quả đƣợc ghi nhận ở bảng 4.4
Bảng 4.3 Mã hóa yếu tố thí nghiệm
Mã hóa Yếu tố -1 0 1 Tỷ lệ (nguyên liệu/dung môi) 1:3 1:5 1:7
Thời gian (giờ) 3 5 7
Bảng 4.4 Kết quả lƣợng cao thu đƣợc khi khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và thời gian đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt Neem
Mẫu nghiệm Thí Tỷ lệ Thời gian Lần 1(g) Lần 2(g) Trung bình(g) D1 +- 1 -1 2,41 2,15 2,28 D2 00 0 0 3,04 3,1 3,07 D3 00 0 0 3,91 3,7 3,8 D6 ++ 1 1 1,61 1,7 1,65 D7 00 0 0 2,12 2,3 2,21 D10 00 0 0 2,05 1,9 1,97 D12 -+ -1 1 2,05 2,1 2,07 D16 00 0 0 2,23 2,3 2,26 D17 -- -1 -1 1,75 1,7 1,72
Trên cơ sở kết quả lƣợng cao thu đƣợc cho thấy điều kiện thí nghiệm có ảnh hƣởng rất lớn đến hiệu suất trích ly cao Neem. Có thể thấy đƣợc thí nghiệm ở 50oC, thời gian trích ly là 5 giờ, tỉ lệ nguyên liệu với dung môi là 1/5, cho hiệu suất thu hồi lƣợng cao là cao nhất. Ở điều kiện này lƣợng cao thu đƣợc lớn nhất là 3,8 g (D3) và thấp nhất là 1,97 g (D10), trung bình là 2.66 g.
Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng cao phụ thuộc vào thời gian trích ly và tỉ lệ giữa nguyên liệu và dung môi
Phân tích sắc kí lỏng cao áp (HPLC), đã xác định đƣợc hàm lƣợng limonoid trong cao Neem thu đƣợc ở bảng 4.5
Bảng 4.5 Kết quả lƣợng limonoid thu đƣợc khi khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và thời gian đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt Neem
Mẫu Thí nghiệm Tỷ lệ Thời gian Khối lƣợng Limonoid (mg) % khối lƣợng D1 +- 1 -1 25,86 0,05 D2 00 0 0 192,95 0,38 D3 00 0 0 87,02 0,17 D6 ++ 1 1 63,17 0,12 D7 00 0 0 67,56 0,13 D10 00 0 0 270,22 0,54 D12 -+ -1 1 80,27 0,16 D16 00 0 0 114,88 0,22 D17 -- -1 -1 18,98 0,09
Trên cơ sở các số liệu về hàm lƣợng limonoid thu đƣợc trên các điều kiện khác nhau về khoảng thời thời gian trích ly, tỷ lệ giữa nguyên liệu và dung môi khác nhau, có thể thấy rằng trong khoảng thời gian 5 giờ tỉ lệ nguyên liệu và dung môi là 1/5 ổn nhiệt ở 50oC sẽ ly trích đƣợc hàm lƣợng limonoid là cao nhất 0,54% (mẫu D10) và thấp nhất là 0,17% (D3), trung bình là 0,35%. So với kết quả của Vũ Văn Độ Và Nguyễn Tiến Thắng là 0,396%. Theo K. Ermel (1995), hàm lƣợng limonoid trong hạt Neem phụ thuộc rất nhiều vào khí hậu, tuổi cây, điều kiện thu hái và bảo quản nhân hạt. Vì vậy kết quả này phù hợp với những công trình nghiên cứu trƣớc đó.
Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng limonoid phụ thuộc vào thời gian trích ly và tỉ lệ giữa nguyên liệu và dung môi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.3. Khảo sát ảnh hƣởng của việc hỗ trợ xử lý nguyên liệu bằng vi sóng đến hiệu suất trích ly limonoid từ hạt Neem đến hiệu suất trích ly limonoid từ hạt Neem
Bảng 4.6 Kết quả lƣợng cao thu đƣợc khi xử lý nguyên liệu bằng vi sóng
Công suất Thời gian
495W 630W 900W
10 phút 0,95 g 0,75 g 0,44 g
Hình 4.5 Biểu đồ thể hiện lƣợng cao thu đƣợc khi xử lý nguyên liệu ở các khoảng thời gian và công suất khác nhau
Phân tích sắc kí lỏng cao áp (HPLC), đã xác định đƣợc hàm lƣợng limonoid trong cao Neem thu đƣợc ở bảng 4.7
Bảng 4.7 Kết quả lƣợng limonoid thu đƣợc khi xử lý nguyên liệu bằng vi sóng Thời gian (phút) Lƣợng limonoid thu đƣợc (mg) 495 W % khối lƣợng 630 W % khối lƣợng 900 W % khối lƣợng 10 55,67 0,39 57,84 0,4 109,97 0,77 15 141,32 0,99 99,12 0,69 44,6 0,31
Hình 4.6 Biểu đồ thể hiện lƣợng Limonoid khi xử lý nguyên liệu ở các công suất và khoảng thời gian khác nhau
Trên cơ sở kết quả phân tích lƣợng limonoid bằng HPLC cho thấy sự ảnh hƣởng của vi sóng đến hiệu suất trích ly là rất lớn. Xác định đƣợc khoảng thời gian 15 phút ở công suất 495 W cho hiệu suất thu hồi limonoid là ƣu việt. Việc sử dụng vi sóng để xử lý nguyên liệu sẽ góp phần nâng cao hiệu suất và rút ngắn thời gian trích ly từ 5 giờ xuống 15 phút. Từ khoảng thời gian 5 giờ tỉ lệ nguyên liệu với dung môi là 1/5, ổn nhiệt ở 50 0C thu đƣợc lƣợng limonoid là 0,35%, thì với việc sử dụng vi sóng trong 15 phút và mức công suất vi sóng là 495 W thu đƣợc lƣợng limonoid là 0,99%. Khoảng thời gian trích ly đƣợc rút ngắn xuống 20 lần và lƣợng limonoid thu hồi cao gấp 2,8 lần.
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
- Xây dựng đƣợc quy trình trích ly limonoid trong hạt Neem với hiệu suất cao, từ 50 g bột hạt Neem khô chứa các hoạt chất, trong đó hàm lƣợng