Phƣơng pháp HPLC (High performance liquid chromatography) là một phƣơng pháp phân tách sắc ký dựa trên sự phân chia khác nhau giữa hai pha luôn tiếp xúc không trộn lẫn vào nhau. Trong đó, pha động là chất lỏng đƣợc đẩy qua pha tĩnh trong cột dƣới áp lực của một bơm cao áp. Pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đƣợc phân chia dƣới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn hay một chất mang đã đƣợc biến đổi băng liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ. Sắc ký lỏng phân tách dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố khối lƣợng, trao đổi ion, loại cỡ hay tƣơng tác hoá học trên bề mặt.
Sắc ký nói chung và HPLC nói riêng có 3 ứng dụng chính: định tính, sắc ký điều chế, định lƣợng và xác định giới hạn tạp chất .
Quá trình phân tách trong phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là do quá trình vận chuyển và phân bố chất tan giữa hai pha là khác nhau. Khi pha động di
chuyển với một tốc độ nhất định sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lƣu giữ trong cột ra khỏi cột. Tuỳ theo bản chất pha động, pha tĩnh, chất tan mà quá trình rửa giải tách đuợc các chất ra khỏi cột. Khi ra khỏi cột mỗi chất sẽ đƣợc phát hiện và ghi lại dƣới dạng pic. Tín hiệu của quá trình sắc ký cho chúng ta sắc ký đồ. Một sắc ký đồ có một hay nhiều pic phụ thuộc vào mẫu có một hay nhiều thành phần.
Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC a. Hệ thống bơm
Bơm đƣợc xem là một trong các thành phần quan trọng nhất của hệ thống sắc ký. Bơm có tác dụng đẩy dung dịch pha động qua cột với một tốc độ hằng định.
Có hai loại bơm
Một loại bơm đẳng dòng (Isocratic pump)
Hai là loại bơm chƣơng trình dung môi và tốc độ dòng (Gradient pump)
b. Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi
Bình chứa dung môi thƣờng đƣợc làm bằng thuỷ tinh, đôi khi là thép không gỉ. Cần lọc các hạt trong dung môi (thƣờng dùng các màng lọc cỡ lỗ 0,45µm) và đuổi khí hoà tan trong dung môi (thƣờng dùng máy siêu âm đuổi khí). Trong phƣơng pháp thông thƣờng chỉ cần một bình dung môi. Trong phƣơng pháp gradient có thể cần đến 2, 3, 4 bình chứa dung môi.
c. Hệ tiêm mẫu
Để đƣa mẫu vào cột có thể dùng bơm tiêm để tiêm vào đầu cột. Phƣơng pháp phổ biến là dùng van tiêm có vòng chứa mẫu (sample loop) có dung tích xác định và chính xác, có thể thay đổi vòng chứa mẫu với các dung tích khác nhau. Một số máy HPLC có hệ thống tiêm mẫu tự động có thể lập trình điều khiển thể tích tiêm (microsyringe), số lần tiêm và chu kì rửa vòng chứa mẫu.
d. Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao
Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao có thể coi là bộ phận quan trọng nhất của hệ thống sắc ký vì ở đây xảy ra quá trình phân tách các chất. Cột có ảnh hƣởng lớn tới khả năng tách các chất cần phân tách. Cột đƣợc chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với
hóa chất, chịu đƣợc áp suất cao đến vài trăm bar. Trong cột nhồi pha tĩnh của hệ sắc ký. Cột có nhiều kích cỡ khác nhau, tuỳ mức độ và mục đích của quá trình sắc ký. Một cột phân tích thông thƣờng dài 10-30cm có đƣờng kính 4-10mm, hạt nhồi cột cỡ 5-10µm, số đĩa lý thuyết 40.000 – 60.000 Với chất nhồi cột cỡ 3-5µm có thể dùng các cột ngắn (3 - 7,5 cm) và nhỏ (đƣờng kính trong 1 - 4, 6mm), số đĩa lý thuyết có thể lên đến 100.000 và cột này có hiệu lực rất cao.
e. Detector trong HPLC
Là bộ phận phát hiện các chất trong pha động khi nó ra khỏi cột sắc ký liên tục. Đó là bộ phận thu nhận, phát hiện các hợp chất của chúng dựa theo một tính chất nào đó của chất cần phân tích. Các loại detector phổ biến
Detector UV-VIS (Utraviolet/Visible Spectrophotometric Detertor)
Detector huỳnh quang (Fluorescence Detector)
Detector khối phổ (Mass Spectrophometric Detector)
Detector điện hoá (Electrochemical Detector)
Detector tán xạ bay hơi (Evaprative Light Scattering Detector)
Detector đo độ dẫn điện (Electrical Conductivity Detector)
Detector đo chỉ số khúc xạ (Refractive Index Detector)
Detector chuỗi Diod (Diod Array Detector)
f. Bộ phận ghi tín hiệu: Recorder g. Bộ điều khiển: Computer