M cl c
2.3. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
2.3.1. Thu thập mẫu bệnh
Mẫu bệnh được thu thập khi mới bắt đầu xuất hiện triệu chứng bệnh hoặc đã thể hiện triệu chứng bệnh điển hình nhưng vẫn phân biệt được rõ ràng giữa phần mô bệnh và mô khỏe. Các mẫu chuối được thu thập tại các chợ và siêu thị, rồi cho từng trái bệnh vào từng bao giấy riêng biệt, mang về tiến hành quan sát, phân lập.
2.3.2. Phương pháp xác định thành phần nấm gây hại trên chuối
Nguyên tắc giám định
Nấm được định danh dựa vào các đặc điểm tản nấm, đính bào đài và bào tử và được giám định theo 4 bước của quy tắc Koch ( grios, 2005). Sau đó, đối với mỗi tác nhân gây bệnh sẽ lây nhiễm nhân tạo .
Xác định nấm gây hại theo quy tắc Koch, gồm bốn bước:
* Bước 1: Mô tả triệu chứng và quan sát tìm mầm bệnh trong mơ bệnh trên trái và bộ phận cùi chuối.
* Bước 2: Phân lập, tách ròng và định danh tác nhân gây bệnh.
Quan sát mơ bệnh và tác nhân gây bệnh dưới kính soi nổi để ghi nhận màu sắc và cách mọc sợi nấm hay sự hình thành ổ nấm của từng lồi nấm trên trái và bộ phận cùi chuối. Nếu mơ bệnh mới xuất hiện triệu chứng nhưng chưa có sự phát triển của tác nhân gây bệnh thì tiến hành ủ bệnh hoặc phân lập trên môi trường W .
- Sau khi quan sát dưới kính soi nổi, tiến hành làm tiêu bản và quan sát dưới kính hiển vi để mơ tả hình dạng, màu sắc của sợi nấm, bào tử, đính bào đài.
- Xác định chi nấm gây bệnh: dựa vào khóa phân loại nấm của Barnett và Hunter (1998) để phân loại nấm tới loài và các tài liệu đã báo cáo khác.
- Phân lập mô bệnh trên W bằng cách: cắt phần mô bệnh thành từng mảnh nhỏ có kích thước 2 x 2 mm, thanh trùng bằng cồn 70o trong 60 giây, rửa lại bằng nước cất thanh trùng hai lần và được làm khô bằng giấy thanh trùng và đặt khoảng 5 miếng vào đĩa petri chứa W . Sau hai ngày nhận thấy có sự phát triển của hệ sợi nấm từ mô bệnh rồi cấy truyền sang môi trường PD .
- Phân lập trực tiếp từ mơ bệnh khi có sự xuất hiện sợi nấm: phân lập tác nhân trực tiếp trên PD và tách ròng làm thuần bằng phương pháp cấy đơn bào tử hay đỉnh sinh trưởng sợi nấm theo phương pháp của Burgess và ctv. (2009) và cất trữ
20
nguồn nấm để thực hiện các thí nghiệm kế tiếp. Quan sát sự phát triển của tản nấm trên môi trường PD , ghi nhận các chỉ tiêu như màu sắc, cách mọc trên môi trường, tiến hành đo đường kính của tản nấm, hình dạng, màu sắc và kích thước bào tử trên mơi trường PD ở thời điểm 7 ngày sau khi cấy (NSKC).
Ngoài ra, thực hiện phương pháp nuôi cấy trên lame theo Wijedasa và Liyanapathirana (2012) để quan sát rõ đặc điểm cách đính bào tử hay đĩa áp của nấm, giúp định danh nấm một cách chính xác. Phương pháp thực hiện: đĩa Petri chứa 1 miếng lam, lamelle và giấy thấm được thanh trùng, sau đó cắt một đoạn mơi trường W được nấu tan và để nguội cho lên miếng lame và cấy nấm lên 2 đầu của miếng mơi trường và đậy lammelle. Sau đó ủ ở nhiệt độ phịng cho nấm phát triển và quan sát dưới kính hiển vi.
* Bước 3: Lây nhiễm mầm bệnh đã phân lập vào trái và bộ phận cùi chuối khỏe, sạch bệnh. Quan sát và mô tả lại triệu chứng bệnh xuất hiện.
Chuẩn bị trái và bộ phận cùi chuối có bề mặt sáng, khơng bị dập, khơng có các chấm đen, đồng đều để tiến hành lây bệnh nhân tạo.
Phương pháp lây bệnh nhân tạo: nuôi cấy nguồn nấm cần lây bệnh trong đĩa Petri, sau đó tạo điều kiện thuận lợi cho nấm bệnh phát sinh bào tử. Các trái và bộ phận cùi chuối được rửa sạch bụi bẩn và sát trùng bề mặt bằng cách ngâm trái chuối (khoảng 1 phút) và cùi chuối (2-3phút) trong cồn 700, kế tiếp lấy ra để vào rổ, cuối cùng đặt dưới đèn cực tím cho khơ tự nhiên trong khoảng 15 phút.
Chuẩn bị hộp nhựa chứa mẫu lây bệnh nhân tạo như sau: đặt vào rổ 3-4 lớp khăn giấy thấm thanh trùng, lấy ống nhỏ giọt hút hoảng 20ml nước cất thanh trùng nhỏ đều cho giấy thấm đều nước để tạo ẩm độ. Tiếp theo, tiến hành lây bệnh nhân tạo bằng cách dùng kim tiêm tạo vết thương trên phần vỏ trái (nếu lây bệnh qua vết thương), sau đó lấy ống nhỏ giọt nhỏ 2-5 giọt huyền phù bào tử nấm vào vị trí đã tạo vết thương hoặc lây bệnh bằng cách phun huyền phù bào tử trực tiếp cho ướt đều lên vỏ trái và bộ phận cùi. Đặt trái chuối bị lây bệnh nhân tạo vào trong hộp nhựa đã chuẩn bị như trên, đậy nắp lại ở điều kiện 250C, tránh ánh nắng trực tiếp. Sau khi lây bệnh tiến hành theo dõi từng ngày để ghi nhận sự xâm nhiễm của nấm gây bệnh trên trái và bộ phận cùi chuối, chụp hình ở thời điểm 7 ngày sau khi lây bệnh.
* Bước 4: Tái phân lập mầm bệnh từ vết bệnh được lây bệnh nhân tạo và so sánh với mầm bệnh lúc ban đầu.
21
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN