CHƯƠNG 1 : LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ thuần của lúa
Những thay đổi về đặc điểm riêng biệt của các giống lúa làm suy giảm hoặc mất đi những tính chất q vốn có của giống gọi là sự thối hóa (Nguyễn Văn Hoan, 2006). Các nguyên nhân gây ra thối hóa các giống lúa
1.5.1 Lẫn cơ giới
Đây là nguyên nhân trực tiếp lớn nhất do sự trộn lẫn giữa hạt giống của giống này vào lô
hạt giống của giống khác trong các trường hợp: sót lại hạt giống của vụ trước, lẫn cơ giới trong quá trình làm mạ, lẫn cơ giới trong quá trình thu hoạch, bảo quản hạt giống (Nguyễn Văn Hoan, 2006). Tương tự Nguyễn Phước Đằng (2010) cũng cho rằng có sự lẫn lộn hạt giống trong khi các dụng cụ thu hoạch và sàng sẩy hạt.
1.5.2 Lai tự nhiên
Ở cây lúa có một tỷ lệ thụ phấn chéo nhất định phụ thuộc vào thời gian mở vỏ trấu, độ vươn ra của vòi nhụy và thời gian tung phấn nhanh hay chậm của bao phấn khi nở hoa.
Nếu vòi nhụy dài, thời gian mở vỏ trấu lâu, bao phấn tung phấn chậm, sau khi hoa lúa đã nở mà ở ngay sát cạnh có gieo trồng các giống lúa khác cũng nở hoa cùng thời gian thì tỷ lệ lai tự nhiên tăng cao và các con lai lại tiếp tục lai với các cá thể khác trong giống sẽ
làm cho độ thuần giảm, đặc điểm của giống mất đi. Theo Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí
Bửu (2008) thì tỷ lệ giao phấn tự nhiên ở lúa cao sản là khoảng 2%, lúa mùa cổ truyền là 10-40% và 40-100% đối với các giống lúa hoang có cùng bộ gen AA với lúa trồng như
Oryza rufipogon, Oryza nivara. Các dạng lúa như nếp Bắc, nếp Hoa vàng, các dạng trổ
sớm ở Tám Đen, Tám Xoan, Nàng Thơm, Nàng Hương đều là các con lai tự nhiên
(Nguyễn Văn Hoan, 2006).
1.5.3 Tích lũy mầm bệnh
Một số bệnh gây hại trên lúa truyền qua hạt như lúa von, cháy lá lúa, đốm nâu, đốm sọc vi khuẩn, tuyến trùng. Khi sử dụng lơ hạt có mầm bệnh để gieo trồng thì bệnh sẽ tái sinh
trưởng ở vụ sau, phá hoại cây lúa nghiêm trọng. Từ đó giá trị của lơ hạt sẽ giảm đi đồng
thời gây thất thu về năng suất và chất lượng nông phẩm (Nguyễn Văn Hoan, 2006). Bên cạnh đó do ảnh hưởng có tính chọn lọc của sâu bệnh có thể làm thay đổi đặc điểm di
truyền của giống ở vụ sau (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu., 2008)
1.5.4 Gieo trồng trong điều kiện khơng thích hợp
Một giống lúa sẽ không phát huy hết tiềm năng nếu trồng trong điều kiện không được
đảm bảo bên cạnh đó có thể xuất hiện các dạng biến dị lấn át giống cũ. Ví dụ như đối với
dạng gạo đỏ và có râu. Đất kiềm thúc đẩy sự xuất hiện của các dạng không thơm ở giống
Tám Đen (Nguyễn Văn Hoan, 2006).
1.6 Chọn dòng thuần-chọn lọc cá thể một lần
Chọn dòng thuần hay còn gọi là phục tráng giống lúa là khơi phục lại tính đồng đều và
các đặc tính ban đầu trong cùng một giống. Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến đối với những giống lúa đã và đang sản xuất nhưng sau một thời gian thiếu chọn lọc nên đã bị thối hóa khiến cho quần thê khơng cịn đồng đều, năng suất, tính chống chịu và
chất lượng suy giảm (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008). Dòng thuần với ưu điểm là tính đồng nhất về kích thước, hình dạng, mùi vị, màu sắc rất quan trọng với việc trồng cơ giới hóa cũng như thu hoạch và tính ổn định sẽ tránh được những sự thay đổi trong bộ máy di truyền do chọn lọc tự nhiên (Nguyễn Phước Đằng, 2010) nên việc chọn lọc càng trở nên quan trọng. Trong chọn lọc dòng thuần đơn vị chọn lọc là thế hệ con của một cây đồng hợp tử với mục đích chọn ra những dịng đồng hợp tử không thay đổi từ thế hệ này sang thế hệ khác. Chọn lọc bắt đầu bằng chọn các cá thể từ quần thể ban đầu, tiếp theo là đánh giá và tiếp tục chọn lọc giữa các dòng theo gia phả của cây đã chọn lọc ban đầu. Cuối
cùng xác định được dòng thuần tốt nhất rồi nhân lên phổ biến làm giống cải tiến (Vũ
Đình Hịa và ctv., 2005).
Theo Nguyễn Ngọc Đệ (2008) chọn dòng thuần hay chọn lọc cá thể là phương pháp áp dụng cho những quần thể giống gốc ban đầu có sự biến động di truyền nhất định gồm
các bước sau
Bước 1: Thu các cá thể có đặc tính mong muốn từ quần thể biến động di truyền.
Bước 2: Trồng mỗi cá thể thu được thành từng dòng riêng biệt để chọn lọc và đánh giá.
Bước 3: So sánh các dòng lúa triển vọng với dòng khác và giống gốc ban đầu.
1.7 Kỹ thuật điện di protein SDS-PAGE và ứng dụng trong công tác phục tráng giống lúa
1.7.1 Kỹ thuật điện di protein SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate polyacrylamie gel electrophoresis) electrophoresis)
Phương pháp điện di protein SDS-PAGE là phương pháp dùng để xác định trọng lượng
phân tử các loại protein thông qua phổ điện di (Garfin, 1995) bao gồm các bước chính: ly trích protein, tinh sạch protein và điện di. Phương pháp đã được Laemmli (1970) phát triển bằng cách thêm 0,1% SDS (chất tẩy mang điện tích âm) vào hệ PAGE của Ornstein-Davis (1964) khi phân tách 28 thành phần của T4-phage. SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) là chất tẩy mang điện tích âm bám rất mạnh vào protein làm protein
đang bị gấp biến dạng thành hình que và được bao bọc bởi SDS cộng với tác nhân khử
cầu nối disulfite của 2-mercaptoethanol hoặc dithiotheitol làm cho protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 chuyển thành chuỗi polypeptide bậc một và đều mang điện tích âm chỉ khác
biệt nhau về kích thước, thơng qua phương pháp điện di SDS-PAGE sẽ phân tách được các loại protein theo trọng lượng phân tử dưới tác dụng của điện trường. Phương pháp điện di protein SDS-PAGE có rất nhiều ứng dụng trong nghiên cứu, đánh giá và chọn tạo
giống cây trồng
Dấu di truyền trong công tác chọn tạo giống: Giống như DNA, protein dự trữ trong hạt cũng được xem là dấu phân tử vì chúng có độ đa hình cao thơng qua
phân tích trọng lượng phân tử và đánh giá tính đa hình và phổ biến (Phạm Văn
Phượng, 2005), sự đa hình xuất hiện ngay cả bên trong và giữa các quần thể chẳng hạn như tập đoàn giống lúa cổ truyền ven biển ở Đồng Bằng Sơng Cửu
Long có độ đa dạng di truyền tương đối cao (Nguyễn Thanh Tường, 2003). Bên
cạnh đó, phương pháp điện di cũng là một công cụ mạnh để xác định tổ tiên hoang dại và sự tiến hóa của các lồi cây trồng (Võ Cơng Thành, 2003).
Xác định độ thuần của giống: Phương pháp điện di cho kết quả chính xác hơn so
tính ổn định) do DUS thường dựa trên những đánh giá về mặt hình thái dễ bị ảnh
hưởng bởi mơi trường (Goodrich và ctv., 1985). Ưu điểm của phương pháp này là xác định nhanh, tương đối rẻ tiền so với kỹ thuật DNA, không cần phải trồng cây
chờ đến khi thu hoạch và không bị ảnh hưởng bởi môi trường, tuy nhiên vẫn có một bất lợi là phương pháp này bị ảnh hưởng bởi tính chuyên biệt của mô và giai
đoạn phát triển (Phạm Văn Phượng, 2005).
1.7.2 Ứng dụng trong công tác phục tráng giống lúa
Đề tài “Phục tráng giống lúa Tài Nguyên mùa cho tỉnh Tiền Giang” do Phạm Văn Phượng, Nguyễn Bảo Vệ, Trần Thượng Tuấn thực hiện nhằm tìm ra giống lúa Tài nguyên mùa thuần chủng, hàm lượng protein cao, hàm lượng amylose trung bình thích hợp điều kiện sinh thái của tỉnh Tiền Giang. Thông qua thu thập mẫu giống lúa Tài nguyên mùa tại tỉnh Tiền giang và tiến hành thanh lọc, phục tráng giống bằng kỹ thuật
điện di protein SDS-PAGE đã chọn ra được 2 dịng lúa thuần chủng, có hàm lượng
protein cao hơn 10%, hàm lượng amylose trung bình (dưới 24%), năng suất cao hơn
giống cũ (>15%), kháng một số loại sâu bệnh chính, độ thuần đảm bảo tiêu chuẩn giống do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành 1998, đáp ứng tiêu dùng và xuất khẩu.
Theo Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ năm 2011, các đề tài “ Phục tráng giống nếp CK92 có chất lượng tốt”, “Phục tráng giống nếp CK2003”, “Phục tráng giống nếp NK2 có chất lượng tốt” do Võ Công Thành thực hiện với việc thanh lọc và tuyển chọn bằng
phương pháp điện di protein SDS-PAGE đã đạt được những thành công
Chọn được 2 dịng CK92 ưu tú. Và thơng qua khảo nghiệm cơ bản với giống đối chứng nếp CK92 địa phương tại huyện Phú Tân vào 2 vụ Đông Xuân 2008-2009, Hè Thu 2009 chọn được dòng đạt mục tiêu năng suất cao 6,5-,5 tấn/ha, hàm lượng amylose thấp < 3%, hàm lượng protein cao > 10%, độ bền thể gel cấp 1.
Chọn được 3 dòng CK2003 ưu tú đạt mục tiêu năng suất cao 6,5-,5 tấn/ha, hàm lượng amylose thấp < 3%, hàm lượng protein cao > 10%, độ bền thể gel cấp 1.
Chọn được chọn được 1 dòng NK2 đạt mục tiêu năng suất cao 6,5-5 tấn/ha, hàm
CHƯƠNG 2
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian: Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 4 năm 2011 đến tháng 4 năm 2013. Địa điểm: Phịng thí nghiệm Di truyền chọn giống và Ứng dụng Công nghệ sinh học, bộ
môn Di truyền giống Nông Nghiệp, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường
Đại Học Cần Thơ.
2.2 Phương tiện
2.2.1 Vật liệu thí nghiệm
Giống lúa Cửu Long 8 được thu từ cơ sở giống 5 Châu tại xã Thanh Mỹ, huyện Châu Thành, tỉnh Trà Vinh.
Bảng 2.1 Đặc tính của giống Cửu Long 8 (CL8) Đặc tính giống
Thời gian sinh trưởng (TGST) 90-95 ngày
Chiều cao cây 90-95 cm
Số hạt chắc/bông 134-162 hạt Số bông/buội 8-15 Trọng lượng 1000 hạt 24-25 g Hàm lượng amylose 27 % Đặc tính thích nghi và chống chịu
Chống chịu phèn, mặn khá. Kháng rầy nâu rất tốt (cấp 3). Nhiễm nhẹ bệnh cháy lá (cấp 5-6), chống chịu trung bình với bệnh vàng lùn, chống chịu tốt với bệnh lùn xoắn lá.
2.2.2 Dụng cụ thí nghiệm và hóa chất
Bên ngồi nhà lưới: chậu mũ, phân bón, thuốc trừ sâu,…
Dụng cụ trong phịng thí nghiệm: Cối, chày nghiền mẫu, cân điện tử, máy li tâm, máy đo hàm lượng protein, máy vortex, bộ dụng cụ điện di protein tổng số, ống
tp, Pipet, lị vi sóng, máy đo quang phổ,…
Hóa chất: Tris L, Kit L, SDS (Sodium Dodecyl Sulfate), Acrylamide, Ammonium Persulfate (AP), Tetra Methylethylenediamine (TEMED), Comassive Brilliant Blue R250, Buffer,…
2.3 Phương pháp
2.3.1 Phương pháp nghiên cứu
Bước 1: Thu thập hạt giống Cửu Long 8 (CL8) từ cơ sở bán giống lúa của nông dân tại
xã Thanh Mỹ, huyện Châu Thành, tỉnh Trà Vinh.
Bước 2: Lấy ngẫu nhiên 20 hạt chắc, không bị sâu bệnh để kiểm tra độ thuần thông qua
phương pháp điện di protein SDS-PAGE. Nếu không thuần, chọn phân nửa hạt tương
ứng với giếng có band waxy nhạt đem đi trồng trong từng chậu và đánh dấu là một dòng
riêng biệt (vụ 1).
Bước 3: Tiến hành lấy chỉ tiêu nông học, thành phần năng suất tất cả các dòng so sánh với đối chứng là giống CL8 đang được sản xuất tại địa phương và đánh giá các đặc tính nào đã bị biến đổi.
Bước 4: Chọn 5 hạt chắc ngẫu nhiên của từng dòng của vụ 1 tiếp tục kiểm tra độ thuần
bằng kỹ thuật điện di protein SDS-PAGE và chọn những cá thể có band waxy nhạt đem trồng tương tự như vụ 1 nếu các dịng vẫn khơng thuần (vụ 2).
Bước 5: Loại bỏ những cá thể sâu bệnh, khơng có khả năng làm địng .Tiếp tục ghi nhận
các chỉ tiêu nông học, thành phần năng suất của từng dòng và so sánh giữa các dòng với
đối chứng.
Bước 6: Kiểm tra độ thuần bằng kỹ thuật điện di protein SDS-PAGE, dòng nào đã thuần
được chọn để đánh giá các chỉ tiêu phẩm chất như hàm lượng amylose, protein, độ trở
hồ, độ bền thể gel.
2.3.2 Đánh giá các chỉ tiêu nông học và thành phần năng suất
Chỉ tiêu nông học
Thời gian sinh trưởng: Thời gian sinh trưởng được ghi nhận từ lúc hạt nảy mầm
đến khi chín trên 85%.
Chiều cao cây: Chiều cao được lấy khi thu hoạch. Đo từ gốc đến chót bơng cao nhất (bông cái).
Chiều dài bông: Đo từ cổ bơng đến chóp bơng. Lấy chỉ tiêu trên 3 bơng và lấy giá trị trung bình.
Số hạt chắc/lép: Đếm số hạt chắc/lép trên 3 bông và lấy trung bình.
Thành phần năng suất
Tổng số chồi, số chồi hữu hiệu trên một bụi.
Số hạt chắc/bông: lặp lại 3 lần.
Trọng lượng 1000 hạt: cân và qui về độ ẩm 14% , lặp lại 3 lần W1, W2, W3 (Trong
đó W0 là trung bình của 3 lần lặp lại).
W14%= 86 ) H 100 ( W0 x 0
2.3.3 Phương pháp đánh giá phẩm chất hạt gạo
Phân tích hàm lượng amylose hạt lúa theo phương pháp của Cagampang và Rodriquez. (1980)
Qui trình phân tích hàm lượng amylose gồm 4 bước sau
Bước 1: Pha bị dung dịch bao gồm Ethanol 95%, HCl 30%, NaOH 1N, Iod (Iod 0,2% +
KI 2%)
Bước 2: Ly trích mẫu
Cân 50 mg nội nhũ đã nghiền mịn cho vào ống 50 ml, thêm 0,5 ml Ethanol 95%, lắc nhẹ
cho đều, thêm 9,5 ml NaOH 1N. Lắc đều và để qua đêm. Bước 3: Pha loãng và đo mẫu
Hút 100 µl dịch trích cho vào bình định mức 25 ml (đối với mẫu thử - mẫu blank, thay dịch trích bằng 100 µl NaOH 1N).
Thêm nước cất đến ½ bình và lắc đều.
Thêm 250 µl HCl 30%, lắc đều.
Thêm 250 µl dung dịch Iod, lắc đều.
Thêm nước cất đến vạch định mức, chuyển sang ống 50 ml và để yên trong 30 phút,
lắc đều trước khi cho vào cuvette, đo độ hấp thụ ở bước sóng 575 nm.
Bước 4: Dựng đường chuẩn và tính kết quả
Đường chuẩn có dạng
Y = aX + b
Trong đó: Y: Độ hấp thụ OD
Tính hàm lượng amylose theo cơng thức
% amylose = 100 2 x
x
Tùy theo hàm lượng amylose các giống có thể phân nhóm thành
Bảng 2.2 Phân nhóm lúa theo hàm lượng amylose (IRRI, 1988)
STT Phân nhóm Amylose (%) Cấp độ
1 Nếp 0-2 Rất thấp
2 Dẻo 8-20 Thấp
3 Mềm cơm 21-25 Trung bình
4 Cứng cơm >25 Cao
Phân tích hàm lượng protein theo phương pháp Lowry và ctv. (1951)
Qui trình phân tích hàm lượng Protein gồm có 4 bước
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch trích
Dung dịch NaOH 0,1N
Dung dịch A (Na2CO3 2% + Na-K-tatrate 0,005% + NaOH 0,1N)
Dung dịch B (CuSO4 0,1%)
Dung dịch C (45 ml dung dịch A + 5 ml dung dịch B)
Dung dịch Folin 1N.
Bước 2: Ly trích mẫu
Cân 10 mg bột gạo đã nghiền mịn cho vào ống 1,5 ml, thêm vào 1 ml NaOH 0,1N. Lắc ít nhất 2 giờ hoặc để qua đêm.
Bước 3: Pha loãng mẫu và đo
Hút 100 µl dịch trích cho vào ống 10 ml (đối với mẫu thử - mẫu blank, thay dịch trích bằng 100 µl NaOH 0,1N) + 1 ml nước cất + 500 µl dung dịch C (chỉ pha trước khi sử dụng 30 phút), lắc đều và để yên trong 10 phút.
Thêm 50 µl Folin 1N, lắc đều và để yên trong 30 phút, cho vào cuvette và đo ở bước sóng 600 nm.
Bước 4: Dựng đường chuẩn
Pha dung dịch gốc Bovine Serum Albumin (BSA).
Đường chuẩn có dạng
Y = aX + b
Trong đó: Y: Độ hấp thụ OD
X: Nồng độ protein máy đo được (mg/ml)
Hàm lượng protein được tính theo cơng thức
% Protein = x 100 m 10 x X với m = 14 100 H%) - (100 x 10
Trong đó: m là trọng lượng thực của mẫu, H% là độ ẩm của hạt
Phương pháp phân tích độ trở hồ theo Jenning và ctv. (1979)
Cách phân tích như sau
Chuẩn bị hai mẫu cho mỗi giống/dòng được thử. Mỗi mẫu lấy sáu hạt gạo, cạo sạch lớp cám, chọn hạt không bị nứt, xếp các hạt vào dĩa petri.
Thêm 10 ml KOH 1,7% vào mỗi dĩa.