CHƯƠNG 2 : PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.3 Phương pháp
2.3.1 Phương pháp nghiên cứu
Bước 1: Thu thập hạt giống Cửu Long 8 (CL8) từ cơ sở bán giống lúa của nông dân tại
xã Thanh Mỹ, huyện Châu Thành, tỉnh Trà Vinh.
Bước 2: Lấy ngẫu nhiên 20 hạt chắc, không bị sâu bệnh để kiểm tra độ thuần thông qua
phương pháp điện di protein SDS-PAGE. Nếu không thuần, chọn phân nửa hạt tương
ứng với giếng có band waxy nhạt đem đi trồng trong từng chậu và đánh dấu là một dòng
riêng biệt (vụ 1).
Bước 3: Tiến hành lấy chỉ tiêu nông học, thành phần năng suất tất cả các dòng so sánh với đối chứng là giống CL8 đang được sản xuất tại địa phương và đánh giá các đặc tính nào đã bị biến đổi.
Bước 4: Chọn 5 hạt chắc ngẫu nhiên của từng dòng của vụ 1 tiếp tục kiểm tra độ thuần
bằng kỹ thuật điện di protein SDS-PAGE và chọn những cá thể có band waxy nhạt đem trồng tương tự như vụ 1 nếu các dịng vẫn khơng thuần (vụ 2).
Bước 5: Loại bỏ những cá thể sâu bệnh, khơng có khả năng làm địng .Tiếp tục ghi nhận
các chỉ tiêu nông học, thành phần năng suất của từng dòng và so sánh giữa các dòng với
đối chứng.
Bước 6: Kiểm tra độ thuần bằng kỹ thuật điện di protein SDS-PAGE, dòng nào đã thuần
được chọn để đánh giá các chỉ tiêu phẩm chất như hàm lượng amylose, protein, độ trở
hồ, độ bền thể gel.
2.3.2 Đánh giá các chỉ tiêu nông học và thành phần năng suất
Chỉ tiêu nông học
Thời gian sinh trưởng: Thời gian sinh trưởng được ghi nhận từ lúc hạt nảy mầm
đến khi chín trên 85%.
Chiều cao cây: Chiều cao được lấy khi thu hoạch. Đo từ gốc đến chót bơng cao nhất (bông cái).
Chiều dài bông: Đo từ cổ bơng đến chóp bơng. Lấy chỉ tiêu trên 3 bơng và lấy giá trị trung bình.
Số hạt chắc/lép: Đếm số hạt chắc/lép trên 3 bơng và lấy trung bình.
Thành phần năng suất
Tổng số chồi, số chồi hữu hiệu trên một bụi.
Số hạt chắc/bông: lặp lại 3 lần.
Trọng lượng 1000 hạt: cân và qui về độ ẩm 14% , lặp lại 3 lần W1, W2, W3 (Trong
đó W0 là trung bình của 3 lần lặp lại).
W14%= 86 ) H 100 ( W0 x 0
2.3.3 Phương pháp đánh giá phẩm chất hạt gạo
Phân tích hàm lượng amylose hạt lúa theo phương pháp của Cagampang và Rodriquez. (1980)
Qui trình phân tích hàm lượng amylose gồm 4 bước sau
Bước 1: Pha bị dung dịch bao gồm Ethanol 95%, HCl 30%, NaOH 1N, Iod (Iod 0,2% +
KI 2%)
Bước 2: Ly trích mẫu
Cân 50 mg nội nhũ đã nghiền mịn cho vào ống 50 ml, thêm 0,5 ml Ethanol 95%, lắc nhẹ
cho đều, thêm 9,5 ml NaOH 1N. Lắc đều và để qua đêm. Bước 3: Pha loãng và đo mẫu
Hút 100 µl dịch trích cho vào bình định mức 25 ml (đối với mẫu thử - mẫu blank, thay dịch trích bằng 100 µl NaOH 1N).
Thêm nước cất đến ½ bình và lắc đều.
Thêm 250 µl HCl 30%, lắc đều.
Thêm 250 µl dung dịch Iod, lắc đều.
Thêm nước cất đến vạch định mức, chuyển sang ống 50 ml và để yên trong 30 phút,
lắc đều trước khi cho vào cuvette, đo độ hấp thụ ở bước sóng 575 nm.
Bước 4: Dựng đường chuẩn và tính kết quả
Đường chuẩn có dạng
Y = aX + b
Trong đó: Y: Độ hấp thụ OD
Tính hàm lượng amylose theo cơng thức
% amylose = 100 2 x
x
Tùy theo hàm lượng amylose các giống có thể phân nhóm thành
Bảng 2.2 Phân nhóm lúa theo hàm lượng amylose (IRRI, 1988)
STT Phân nhóm Amylose (%) Cấp độ
1 Nếp 0-2 Rất thấp
2 Dẻo 8-20 Thấp
3 Mềm cơm 21-25 Trung bình
4 Cứng cơm >25 Cao
Phân tích hàm lượng protein theo phương pháp Lowry và ctv. (1951)
Qui trình phân tích hàm lượng Protein gồm có 4 bước
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch trích
Dung dịch NaOH 0,1N
Dung dịch A (Na2CO3 2% + Na-K-tatrate 0,005% + NaOH 0,1N)
Dung dịch B (CuSO4 0,1%)
Dung dịch C (45 ml dung dịch A + 5 ml dung dịch B)
Dung dịch Folin 1N.
Bước 2: Ly trích mẫu
Cân 10 mg bột gạo đã nghiền mịn cho vào ống 1,5 ml, thêm vào 1 ml NaOH 0,1N. Lắc ít nhất 2 giờ hoặc để qua đêm.
Bước 3: Pha loãng mẫu và đo
Hút 100 µl dịch trích cho vào ống 10 ml (đối với mẫu thử - mẫu blank, thay dịch trích bằng 100 µl NaOH 0,1N) + 1 ml nước cất + 500 µl dung dịch C (chỉ pha trước khi sử dụng 30 phút), lắc đều và để yên trong 10 phút.
Thêm 50 µl Folin 1N, lắc đều và để yên trong 30 phút, cho vào cuvette và đo ở bước sóng 600 nm.
Bước 4: Dựng đường chuẩn
Pha dung dịch gốc Bovine Serum Albumin (BSA).
Đường chuẩn có dạng
Y = aX + b
Trong đó: Y: Độ hấp thụ OD
X: Nồng độ protein máy đo được (mg/ml)
Hàm lượng protein được tính theo cơng thức
% Protein = x 100 m 10 x X với m = 14 100 H%) - (100 x 10
Trong đó: m là trọng lượng thực của mẫu, H% là độ ẩm của hạt
Phương pháp phân tích độ trở hồ theo Jenning và ctv. (1979)
Cách phân tích như sau
Chuẩn bị hai mẫu cho mỗi giống/dòng được thử. Mỗi mẫu lấy sáu hạt gạo, cạo sạch lớp cám, chọn hạt không bị nứt, xếp các hạt vào dĩa petri.
Thêm 10 ml KOH 1,7% vào mỗi dĩa.
Đậy dĩa petri, để yên khoảng 23 giờ ở nhiệt độ phòng.
Bảng 2.3 Phân cấp độ trở hồ của hạt gạo theo Jenning và ctv. (1979)
Cấp Đặc điểm Mức độ
1 Hạt gạo còn nguyên Cao
2 Hạt gạo phồng lên Cao
3 Phồng lên, viền cịn ngun, nở ít Cao 4 Phồng lên, viền còn nguyên, nở rộng Trung bình 5 Hạt rã ra, viền hồn tồn nở rộng Trung bình
6 Hạt tan ra hồn toàn với viền Thấp
7 Hạt tan ra hồn tồn và trong Thấp
Cấp trung bình sẽ được tính theo cơng thức sau Ʃxi x n Cấp trở hồ = N Trong đó: xi: cấp độ trở hồ n: số hạt có cấp độ trở hồ xi N: số hạt thử nghiệm
Bảng 2.4 Đánh giá độ trở hồ theo IRRI (1988)
Loại Nhiệt độ Giá trị tan rã trong môi trường kiềm (cấp)
Thấp 55-69 6-7
Trung bình 70-74 4-5
Cao 75-79 2-3
Phương xác định độ bền thể gel theo phương pháp của Tang và ctv. (1991).
Bước 1: Chuẩn bị mẫu
Tách vỏ trấu và đo ẩm độ hạt gạo.
Nghiền mịn và cân mẫu (100 mg với ẩm độ 12%).
Bước 2: Hoàn tan mẫu
Thêm 2 ml KOH 0,2 N. Sau đó khuấy đều bằng máy Vortex.
Đậy nắp kỹ và đun trong nồi cách thủy 100oC trong 5 phút.
Lấy ra, để yên trong 5 phút, sau đó làm lạnh trong nồi nước đá 10 phút.
Bước 3: Đọc và ghi kết quả
Để ống nghiệm nằm ngang trên bề mặt bằng phẳng, để gel chảy từ từ, sau một giờ tiến hành đo chiều dài thể gel (từ đáy đến mí trên của thể gel).
Bảng 2.5 Phân cấp độ bền thể gel theo thang đánh giá của IRRI (1988)
Cấp Chiều dài thể gel (mm) Loại độ bền thể gel
1 80 – 100 Rất mềm
3 61 – 80 Mềm
5 41 – 60 Trung bình
7 35 – 40 Cứng
9 < 35 Rất cứng
Chiều dài và tỷ lệ dài/rộng của hạt gạo
Đo chiều dài và chiều rộng của 10 hạt gạo của mỗi giống/dòng bằng cách xếp nối nhau
trên giấy kẻ li, lấy giá trị trung bình. Đánh giá theo thang điểm của IRRI (1988).
Bảng 2.6 Phân loại hạt gạo theo chiều dài và tỷ lệ dài/rộng (IRRI, 1988)
Cấp Chiều dài hạt (mm) Kích thước Tỷ lệ dài/rộng Dạng hạt
1 > 7,5 Rất dài > 3,0 Thon dài
3 6,61 - 7,5 Dài 2,1 - 3,0 Trung bình
5 5,51 - 6,6 Trung bình 1,1 - 2,0 Hơi tròn
2.3.4 Phương pháp điện di protein SDS-PAGE (Sodium Dodecyl sulfate olyacrylamide Gel Electrophoresis) đánh giá độ thuần của giống Gel Electrophoresis) đánh giá độ thuần của giống
Qui trình phân tích điện di protein tổng số SDS - PAGE gồm 5 bước
Bước 1: Chuẩn bị mẫu
Lấy 3 mg bột nội nhũ (phần khơng có phơi) nghiền mịn cho vào ống 1,5 ml Thêm 100 µl dung dịch ly trích.
Lắc ít nhất 3 giờ hoặc để qua đêm. Ly tâm 14000 vòng/phút trong 3 phút.
Bước 2: Làm gel
Tùy theo chiều dài, rộng và độ dày của khn làm gel
Đổ gel theo qui trình của Sambrook và ctv. (1989).
Cài răng lược giữa hai tấm kính của gel để tạo giếng, thêm 1 giọt nước. Để yên 30 - 60
phút, loại bỏ răng lược, lắp vào khung điện di, cho dung dịch đệm điện di vào ngập các giếng gel.
Bảng 2.6 Công thức pha dung dịch gel
Hóa chất (1 gel) Gel phân tách 12% (ml) Gel cô mẫu 5% (ml)
Nước cất Acrylamide 30% Tris HCl (pH = 8,8) 1,5M Tris HCl (pH = 6,8) 1M SDS 10% Amonium persulfate 10% TEMED 1,6 2,0 1,3 - 1,1 0,05 0,002 0,68 0,17 - 0,13 0,03 0,01 0,001
Bước 4: Tiến hành điện di
Bơm 10 µl dung dịch ly trích mẫu/giếng
Chạy điện di với điện thế 20V ở gel cô mẫu và 40V ở gel phân tách.
Gel được nhuộm trong 2 giờ bằng dung dịch nhuộm 0,2% Coomassie Brilliant Blue
R250
Rửa gel bằng microwave trong 30 phút.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Chọn dòng từ các cá thể được thu thập ban đầu
Từ các cá thể hạt giống lúa Cửu Long 8 (CL8) thu thập chọn ra 20 hạt chắc, không bị sâu bệnh để kiểm tra độ thuần bằng kỹ thuật điện di protein SDS-PAGE.
Giếng
Chú thích: Giếng (*) là giếng được chọn và giếng được chọn là cá thể 2, 3, 4, 8
Hình 3.1 Phổ điện di protein của 10 cá thể ban đầu
Qua kết quả điện di cho thấy các loại protein bị phân tách ra dựa theo trọng lượng phân tử trong đó protein nào có trọng lượng phân tử nhỏ hơn thì chuyển trong gel acrylamide
nhanh hơn, bao gồm các loại protein tương ứng với trọng lượng giảm dần: Proglutelin,
α-Glutelin, Globulin, β-Glutelin và Prolamin, kết quả phù hợp với nghiên cứu của
Tanaka và Yamagata. (1986). Các cá thể có sự khác biệt rõ ràng ở tất cả các band dựa
vào sự ăn màu đậm nhạt khác nhau đối với thuốc nhuộm Commassie Brilliant Blue R250 bao gồm Waxy, Proglutelin, và Prolamin trong đó nhận thấy rõ nhất là band α-Glutelin,
1 2* 3* 4* 5 6 7 8* 9 Waxy 60KDa Proglutelin 57KDa α-Glutelin 37-39KDa Globulin 26KDa β-Glutelin 22-23KDa Prolamin 16KDa Prolamin 13KDa
β-Glutelin và Globulin vì vậy giống Cửu Long 8 (CL8) thu thập lúc đầu chưa thuần, chỉ
có 2 cá thể khơng thể đánh giá được là 1 và 5 vì sai sót trong q trình bơm mẫu. Từ đây ta sẽ chọn những cá thể có hàm lượng amylose thấp thông qua sự biểu hiện của band Waxy nhạt vì theo Võ Cơng Thành (2003) sự biểu hiện của band Waxy trên gel điện di có sự tương quan chặt với hàm lượng amylose. Cá thể phù hợp là 2, 3, 4, 8 và 9. Tuy nhiên ở cá thể 9, nhận thấy band α-Glutelin ăn màu nhạt hơn so với 4 cá thể cịn lại vì theo Cagampang và ctv. (1966) Glutelin chiếm khoảng 80% protein tổng số vì thế dựa vào band α-Glutelin có thể đánh giá được hàm lượng protein trong hạt. Vì thế không
chọn cá thể 9, chọn cá thể 2, 3, 4 và 8.
Giếng
Giếng (*) là giếng được chọn bao gồm giếng 1, 3, 7 (tương ứng với hạt thứ 11, 13, 17).
Hình 3.2 Phổ điện di protein của 10 cá thể sau
Tương tự như ở 10 cá thể đầu, các cá thể sau có sự ăn màu đậm nhạt khác nhau ở phần
lớn các band như ở band Waxy cá thể 1, 3 và 7 có sự ăn màu nhạt hơn so với các cá thể khác, ở band Proglutelin 4 cá thể đầu đã cho thấy sự ăn màu khác nhau rõ rệt tương tự
với band α-Glutelin, β-Glutelin và Globulin vì vậy 10 cá thể sau vẫn không thuần. Chọn 1* 2 3* 4 5 6 7* 8 9 10 Waxy 60KDa Proglutelin 57KDa α-Glutelin 37-39KDa Globulin 26KDa β-Glutelin 22-23KDa Prolamin 16KDa Prolamin 13KDa
tiếp những cá thể có band Waxy nhạt để trồng ở vụ sau bao gồm các cá thể ở giếng số 1, 3 và 7 (hạt thứ 11, 13 và 17). Sau khi chọn các cá thể ưu tú, lấy phần phơi cịn lại tương
ứng với mỗi hạt đem ủ trong dĩa petri và trồng trong nhà lưới.
Qua kết quả điện di, chọn được 7 cá thể. Ký hiệu tên cá thể tương ứng với tên dòng theo Bảng 3.1 Bảng 3.1 Ký hiệu các cá thể được chọn trồng ở vụ 1 STT Tên cá thể Tên dòng 1 2 CL8-2 2 3 CL8-3 3 4 CL8-4 4 8 CL8-8 5 11 CL8-11 6 13 CL8-13 7 17 CL8-17 3.2 Vụ 1 3.2.1 Trồng các cá thể được chọn
Những cá thể/dòng được chọn sau khi kiểm tra độ thuần trồng trong từng chậu riêng biệt (chú ý tạo điều kiện đồng nhất giữa các chậu như lượng phân bón, lượng nước,…), ghi nhận chỉ tiêu nơng học của các dịng và đối chứng (giống được sản xuất đại trà tại địa phương). Tuy nhiên khi đem trồng nửa hạt cịn lại nên sức sống khơng cao nên chỉ có 4
3.2.2 Chỉ tiêu nông học vụ 1
Bảng 3.2 Đặc tính nơng học các dịng và đối chứng vụ 1
STT Tên giống/dòng TGST (ngày) Chiều cao cây (cm) Chiều dài bông (cm)
1 CL8-3 105 113 23,5
2 CL8-4 102 97 22,4
3 CL8-11 107 110 20,0
4 CL8-13 107 115 19,0
5 Đối chứng 108 114 23,0
TGST: Thời gian sinh trưởng
Thời gian sinh trưởng
Các dịng có thời gian sinh trưởng biến thiên từ 102-107 ngày. Theo Nguyễn Thành Hối (2008) giống lúa cực ngắn ngày có thời gian sinh trưởng dưới 90 ngày (nhóm A0), giống ngắn ngày từ 90-105 (nhóm A1), giống trung bình từ 106-120 ngày (nhóm A2), giống dài ngày lớn hơn 120 ngày (nhóm B). Các dịng được chọn đều có thời gian sinh trưởng
thuộc nhóm trung bình, trong đó dịng CL8-4 có thời gian sinh trưởng thấp nhất (102 ngày), dòng CL8-11 và CL8-13 có thời gian sinh trưởng dài nhất (107 ngày). Tất cả các dịng được chọn đều có thời gian sinh trưởng thấp hơn đối chứng (108 ngày). Tuy nhiên khi so sánh thời gian sinh trưởng của giống Cửu Long 8 (CL8) gốc ban đầu là từ 90-95 ngày thuộc giống ngắn ngày nên có thể thấy giống đã bị thối hóa.
Chiều cao cây
Theo Phạm Thị Mùi (2010) thời gian sinh trưởng và chiều cao cây là hai đặc tính đặc
trưng để phân biệt giữa giống thuần và không thuần. Thật vậy, giữa các dịng có sự
chênh lệch về thời gian sinh trưởng và chiều cao cây chứng tỏ các dịng khơng thuần phù hợp với kết quả đã điện di lúc ban đầu.
Chiều cao của các dòng biến thiên trong khoảng từ 97-115 cm, trong đó thấp nhất là
dòng CL8-4 (97 cm) và cao nhất là dòng CL8-13 (115 cm). Theo Akita (1989), chiều cao cây từ 90-100 cm được coi là lý tưởng để tạo năng suất cao vì theo Yoshida (1981)
và De Datta (1981) nhận định thân thấp là một trong những đặc tính hình thái góp phần
vào năng suất lúa cũng như gia tăng khả năng kháng đổ ngã và là một đặc điểm quan
trọng cần được chú ý. Vì thế trong các dòng, dòng CL8-4 với chiều cao là 97 cm đạt được tiêu chuẩn trên.
Chiều dài bơng
Chiều dài bơng của các dịng biến thiên từ 19-23,5 cm, trong đó dịng CL8-13 (19 cm) có chiều dài bông thấp nhất là 19 cm và dịng CL8-3 có chiều dài dài nhất là 23,5 cm.
3.2.3 Thành phần năng suất vụ 1
Bảng 3.3 Thành phần năng suất các dòng và đối chứng vụ 1
STT Tên giống/dịng Số bơng/bụi Hạt chắc/bơng (hạt) TL chắc/bông (%) KL 1000 hạt (g) 1 CL8-3 35 127 84,6 22,50 2 CL8-4 30 130 85,0 23,42 3 CL8-11 28 125 83,2 21,00 4 CL8-13 34 118 74,0 21,70 5 Đối chứng 34 120 80,2 22,30 Số bông/bụi
Kết quả cho thấy số bơng/bụi của các dịng biến thiên từ 28-35 bông Trong đó dịng CL8-11 có số bông/bụi thấp nhất (28 bông) và cao nhất là dòng CL8-3 với 35 bông. Theo Bảng ghi nhận đặc tính nơng học của giống CL8 gốc ban đầu thì số bơng/buội chỉ