CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN
2.2. Quy trình ni cấy
2.2.2.1. Chuẩn bị màng ối
Bánh rau và màng bọc thai của các sản phụ mổ đẻ tại bệnh viện Phụ- Sản Hà Nội. Các sản phụ khoẻ mạnh và đã được sàng lọc các bệnh lây truyền: HIV (Human immunodeficiency virus-virus gây suy giảm miễn dịch mắc phải ở người), HbsAg (Hepatitis B surface antigen-kháng nguyên bề mặt siêu vi B), giang mai, khơng có nhiễm trùng tồn thân, chưa vỡ ối hoặc vỡ ối trước 6
giờ.Cả bánh rau và màng bọc thai được lấy bằng dụng cụ vơ khuẩn tại phịng mổ.
- Định khu màng rau sẽ lấy để làm nền nuôi cấy bằng cách: lấy vùng cách 10 cm kể từ rìa bánh rau.
- Rửa màng rau bằng nước muối sinh lý 0,9% có pha kháng sinh và kháng nấm với nồng độ penicillin 100UI/ml (Wako, Nhật), streptomycin 100µg/ml (Wako, Nhật), amphotericin B 0,25µg/ml trong vịng 10 phút
- Nạo sạch máu ở màng rau bằng nạo tế bào
- Cắt màng rau ở vùng đạt tiêu chuẩn thành các mảnh có diện tích 3x3cm - Rửa màng rau lần lượt hai lần bằng PBS 1X khơng có ion Mg2+ và Ca2+
(Gibco, Mỹ) có pha kháng sinh và kháng nấm với nồng độ penicillin 100UI/ml, streptomycin 100µg/ml, amphotericin B 0,25µg/ml
Màng rau tiếp tục được xử lý hoặc bảo quản lạnh sâu cả ba màng ở nhiệt độ -800C
- Bóc màng ối ra khỏi màng rau
- Ngâm màng ối bằng ammonia 10% (pha từ ammonia 25% của hãng Wako trong PBS 1X không kháng sinh, kháng nấm và khơng có ion Mg2+ và Ca2+)
- Nạo sạch cả hai mặt của màng ối bằng nạo tế bào
- Rửa lại hai lần bằng PBS 1X không kháng sinh, kháng nấm và khơng có ion Mg2+ và Ca2+
- Các mảnh màng ối sẵn sàng được căng trên lồng nuôi cấy để sử dụng tươi hoặc tiến hành bảo quản trong DMSO 15% (Sigma) ở -800C (sử dụng trong vòng 6 tháng)
Khi sử dụng, rã đơng ở nhiệt độ phịng
- Rửa lại bằng PBS 1X khơng có kháng sinh, kháng nấm và khơng có ion Mg2+ và Ca2+
- Đối với màng rau bảo quản cả 3 màng: Ngâm trong ammonia 10% Nạo bỏ lớp biểu mô và trung mô Rửa lại bằng PBS 1X
- Trải màng ối lên bề mặt nhẵn vô khuẩn - Xác định mặt màng ối đã loại bỏ biểu mô
- Căng phẳng màng ối lên lồng nuôi cấy đường kính 24mm, bằng nhựa polycarbonate của hãng Corning (Mỹ) sao cho mặt đã loại bỏ biểu mô màng ối hướng lên trên, khơng có bọt khí chen giữa đáy lồng và màng ối - Để khô sau khoảng 2 giờ
- Sử dụng ln hoặc đóng gói vơ khuẩn (sử dụng trong vịng 1 tháng) - Nuôi cấy tế bào gốc NMM