CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN
2.2. Quy trình ni cấy
2.2.2.2. Chuẩn bị lớp 3T3 làm nền nuôi cấy
a) Chuẩn bị lớp 3T3 (sử dụng mẫu 3T3 bảo quản lạnh, chưa qua xử lý mitomycin)
- Rã đông 1 ống 3T3
- Lấy 8ml DMEM+10%FBS vào ống falcon 14 đáy nhọn - Hút toàn bộ dịch treo 3T3 vào và trộn đều
- Ly tâm 300g, 5 phút ở nhiệt độ phòng - Hút bỏ dịch nổi
- Lấy cặn và làm tan cặn tế bào
- Thêm DMEM+10%FBS vào cặn sao cho số lượng tế bào thu được là 1x106/12ml DMEM+10%FBS, trộn đều và cho vào bình flask 75cm2 - Láng đều đáy flask
- Gặt tế bào sau 3 ngày - Lấy flask ra khỏi tủ ấm - Bỏ hết dịch nổi
- Rửa flask bằng 10ml PBS (khơng ion hóa trị 2)
- Chuẩn bị dung dịch gồm 10ml DMEM+10%FBS+100µl mitomycin C (Sigma)
- Bơm dung dịch vào flask vừa thu hoạch - Ủ trong tủ ấm trong vòng 2 giờ
- Hút bỏ DMEM
- Rửa lại flask 3 lần bằng DMEM, mỗi lần 10ml
- Thêm 2ml trypsin-EDTA 1X vào chai, để tủ ấm 3 phút - Làm bong tế bào khỏi chai
- Thêm 8ml DMEM vào chai - Hút toàn bộ vào ống falcon 14ml - Ly tâm 300g, 5 phút
- Làm tan cặn
- Thêm 10ml DMEM vào ống falcon và trộn đều
- Xác định lượng tế bào trong dungdịch bằng nhuộm trypan blue - Cấy với số lượng 2,5x105tế bàosống/2ml/1 giếng
- Ủ trong tủ ấm
- Sẵn sàng cho nuôi cấy tế bào biểu mô sau 1-3 ngày.
b) Chuẩn bị lớp 3T3 (sử dụng mẫu 3T3 đã qua xử lý mitomycin bảo quản lạnh)
- Rã đơng 1 ống tế bào,thơng thường có mật độ khoảng 3.3x106/ml/tube - Lấy 8ml DMEM 1X (Gibco) có 10% FBS (Gibco) vào ống falcon 14ml
đáy nhọn
- Hút toàn bộ dịch chứa3T3 vào ống falcon
- Ly tâm 400-500g trong vòng 5 phút ở nhiệt độ phòng - Hút bỏ dịch nổi
- Trộn đều cặn, thêm vào 10ml DMEM +10%FBS vào ống trộn đều
- Lấy 10µl dịch treo trộn với 10µl trypan blue 0,4% (Sigma-Mỹ), trộn đều và đếm mật độ tế bàobằng buồng đếm Neubauer
- Pha thành dịch treo với mật độ tế bào 3,5x105 tế bào sống/2ml/1 giếng nuôi cấy
- Ni cấy trong tủ ấm trong vịng 1-3 ngày trước khi nuôi cấy cùng tế bào biểu mô