Kết quả đánh giá hoạt lực của chất xúc tác AlgHis–He, HRP và He–Na được trình bày ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Các thông số động học của phản ứng oxy hóa Guaiacol được xúc tác bởi
AlgHis–He, HRP và He–Na
Xúc tác Km (µM) Vmax (µmol/phút) Vmax/Km
AlgHis–He (1–0,25) 0,2804 0,6299 2,2464 AlgHis–He (1–0,5) 0,1628 0,7670 4,7113 AlgHis–He (1–0,75) 0,3286 1,8848 5,7358 AlgHis–He (1–1) 0,2424 1,1418 4,7104 HRP 9,6467 244,0200 25,2957 He–Na 0,2212 1,0434 4,7170
Hằng số Km thể hiện nồng độ cơ chất để phản ứng đạt được vận tốc V = ½ Vmax, Vmax mơ tả số phân tử cơ chất nhiều nhất được chuyển thành sản phẩm trong một khoảng thời gian. Giá trị Km càng cao, số phân tử cơ chất được chuyển hóa thấp (phức hợp [E–S] bị phá vỡ nhiều hơn [E–S] tạo thành) nên enzyme có ái lực khơng tốt với cơ chất, ngược lại Km càng thấp thì enzyme có ái lực càng cao với cơ chất [64]. Đối với giá trị Vmax, Vmax càng lớn tức số phân tử cơ chất được chuyển thành sản phẩm càng nhiều trong một khoảng thời gian, ái lực enzyme càng cao và ngược lại. Do đó, xúc tác có hoạt lực tốt khi có hằng số Km nhỏ và giá trị Vmax lớn.
50 Hệ xúc tác
Trong Bảng 3.1, xét 4 tỷ lệ của hệ xúc tác AlgHis–He, tỷ lệ 1–0,25 có hằng số Km nhỏ nhất (0,1628) nhưng giá trị Vmax nhỏ (0,7670), tỷ lệ 1–0,75 có hằng số Km lớn nhất (0,3286) nhưng có giá trị Vmax lớn nhất (1,8848). Do đó, hiệu quả xúc tác của các chất có thể được xác định bằng tỷ số Vmax/Km. Trong bốn tỷ lệ của hệ xúc tác AlgHis–He, hiệu quả xúc tác ở tỷ lệ 1–0,75 cao nhất (5,7358) nên có hoạt lực cao nhất. Điều này có thể được giải thích rằng, AlgHis–He xúc tác dựa vào tâm sắt của heme, khi tăng tỷ lệ gắn He, mật độ tâm sắt có trong mẫu càng tăng, đờng thời có sự hỗ trợ của chất mang AlgHis giúp chất xúc tác hòa tan và phân tán tốt trong nước nên hoạt lực xúc tác của mẫu cao. Tuy nhiên khi tăng tỷ lệ gắn He 1–1, hoạt lực của chất xúc tác lại giảm đi do lượng He trong mẫu nhiều, bản chất He là một chất kỵ nước do đó là giảm khả năng hòa tan trong nước dẫn đến làm giảm hoạt lực xúc tác.
Hệ xúc tác AlgHis–He (1–0,75) có hiệu suất tổng hợp và hoạt lực tối ưu nhất trong các tỷ lệ. Do đó, chọn AlgHis–He (1–0,75) để tiến hành so sánh với HRP và khảo sát các đánh giá tiếp theo.
Hệ xúc tác AlgHis–He (1–0,75) có C % là 21,05 %, quy đổi theo hàm lượng He để so sánh với He khơng có chất mang (cùng hàm lượng He), ta có hiệu quả xúc tác Vmax/Km của AlgHis–He (1–0,75) đã quy đổi có giá trị là 27,25 cao gấp 5,77 lần so với He–Na. Do AlgHis–He có sự hỗ trợ của chất mang, giúp hịa tan tốt trong nước nên có hoạt lực vượt trội hơn so với He khơng có chất mang.
Đối với hoạt lực của HRP, từ Bảng 3.1 có thể thấy hoạt lực của HRP (Vmax/Km = 25,2957) cao gấp 4,41 lần so với AlgHis–He (1–0,75) (Vmax/Km = 5,7358). Để tiến hành so sánh khả năng xúc tác và khả năng tạo gel của AlgHis–He (1–0,75) so với HRP, ta đưa hai chất về cùng hoạt lực để so sánh.
3.3. Đánh giá hoạt tính xúc tác trên Pyrogallol
Việc đánh giá hoạt lực của hệ xúc tác AlgHis–He dựa trên cơ sở của q trình oxy hóa tạo thành Purpurogallin của Pyrogallol theo Hình 3.14.
51 Kết quả đánh giá hoạt tính xúc tác của AlgHis–He (1–0,75) và HRP được thể hiện ở Hình 3.15.
Hình 3.15. Phổ UV–Vis của (a) AlgHis–He và (b) HRP với nồng độ H2O2 khác
nhau
Hình 3.15a thể hiện phổ UV–Vis của phản ứng oxy hóa Pyrogallol với xúc tác AlgHis–He (1–0,75) ở nhiều nồng độ H2O2 khác nhau (2 – 100 mM). Nhìn chung, khi tăng nờng độ H2O2 từ 2 – 100 mM, độ hấp thụ tăng dần ở bước sóng 420 nm. Độ hấp thụ tăng dần vì H2O2 là chất oxy hóa mạnh, khi nờng độ H2O2 càng lớn, lượng sản phẩm oxy hóa của Pyrogallol được tạo ra (Purpurogallin) càng nhiều nên độ hấp thụ tăng dần. Chứng tỏ, hoạt tính xúc tác của AlgHis–He (1–0,75) tăng dần theo nồng độ H2O2.
Phổ UV–Vis của phản ứng oxy hóa Pyrogallol với xúc tác HRP ở nhiều nồng độ H2O2 khác nhau (2 – 100 mM) được thể hiện ở Hình 3.15b. Độ hấp thụ ở bước sóng 420 nm tăng dần với nờng độ H2O2 tăng từ 2 – 10 mM, sau đó giảm dần khi tăng nồng độ H2O2 từ 10 – 100 mM. Từ phân tích trên cho thấy hoạt tính xúc tác của HRP tăng với nồng độ H2O2 tăng 2 – 10 mM, hoạt tính giảm dần khi tăng H2O2 từ 10 – 100 mM. Do ở nồng độ H2O2 cao, HRP bị ức chế do hợp chất trung gian II (Por.+FeIV=O) bị oxy hóa tạo ra một dạng enzyme hầu như không hoạt động HRP (III), gây bất hoạt enzyme làm giảm hoạt tính [4]. Hoạt tính xúc tác của HRP đạt mức cao nhất ở nồng độ H2O2 10 mM.
Hình 3.16 so sánh khả năng xúc tác của HRP và hệ AlgHis–He (1–0,75) trên nền Pyrogallon theo nồng độ H2O2. Khi tăng nồng độ H2O2 từ 2 – 100 mM, hoạt tính xúc tác của hệ AlgHis–He tăng dần do lượng sản phẩm oxy hóa của Pyrogallol tạo ra tăng dần. Đối với enzyme HRP, hoạt tính xúc tác tăng vọt ở H2O2 nồng độ 2 – 10 mM
52 và sau đó giảm dần khi tăng nờng độ H2O2 10 – 100 mM. Từ đó thấy được nờng độ H2O2 tối ưu cho HRP ở 10 mM, ở nồng độ H2O2 cao, enzyme HRP bị bất hoạt làm giảm hoạt tính xúc tác. Từ kết quả phân tích trên cho thấy hoạt tính xúc tác của hệ AlgHis–He ổn định hơn HRP khi tăng nồng độ H2O2. Hoạt tính của AlgHis–He tăng dần và khơng bị ức chế bởi nồng độ H2O2 cao, mở ra nhiều ứng dụng tiềm năng trong sinh học.
Hình 3.16. Đờ thị hoạt tính xúc tác của HRP và hệ AlgHis–He (1–0,75) theo nồng
độ H2O2
3.4. Kết quả gây độc tế bào nguyên bào sợi
3.4.1. Kết quả theo phương pháp nhuộm Sulforhodamine B
Kết quả gây độc nguyên bào sợi (Fibroblast) bằng phương pháp nhuộm SRB được thể hiện trên Hình 3.17.
Hình 3.17 cho thấy cho thấy AlgHis–He có khả năng gây độc tế bào trên nguyên bào sợi không đáng kể, tỷ lệ phần trăm tế bào sống sót của AlgHis–He là 86,42 % nhỏ hơn 8,54 % sau 48 giờ cấy so với mẫu đối chứng (94,96 %). Điều này có thể lý giải do sự có mặt của His trong AlgHis–He là nguyên nhân gây ra độc tính, khả năng tờn tại của tế bào có xu hướng giảm khi lượng His lớn. Tuy nhiên, khơng gây độc tính tế bào đáng kể [65, 66].
53