Với hàm lượng chất nền Gel–Tyr 15 %, hàm lượng hệ xúc tác 0,1 %; hàm lượng H2O2 0,04 %, thời gian gel hóa của Gel–Tyr với hệ xúc tác AlgHis–He (1– 0,75), HRP và He–Na được thể hiện trên Hình 3.22. Thời gian gel hóa với xúc tác HRP là nhanh nhất (17 s), tiếp theo là hệ xúc tác AlgHis–He (1–0,75) với thời gian 25 s và thấp nhất là He–Na (70 s). Chứng tỏ khi có chất mang, khả năng tạo gel của He vượt trội hơn nhiều lần so với He–Na. Thời gian gel hóa với hệ xúc tác AlgHis– He (1–0,75) có sự chênh lệch khơng đáng kể so với xúc tác HRP (8 s). Điều này cho thấy, trên phương diện hình thành hydrogel, hệ AlgHis–He có thể thay thế cho enzyme HRP trong quá trình xúc tác tạo hydrogel.
Hình 3.23a cho thấy trạng thái của hỗn hợp trước khi tạo gel và Hình 3.23b là trạng thái sau khi hình thành gel trên nền Gel–Tyr với xúc tác AlgHis–He. Hỗn hợp khi chưa tạo gel gờm Gel–Tyr, xúc tác AlgHis–He và nước có trạng thái lỏng do chưa có tác nhân H2O2 kích hoạt q trình gel hóa. Sau khi thêm H2O2, gel được hình thành có cấu trúc mạng khơng gian ba chiều, khơng cịn khả năng lưu biến, có trạng thái đặc (Hình 3.23b).
58
Hình 3.23. Trạng thái trước và sau khi tạo hydrogel trên nền Gel–Tyr với xúc tác
59
KẾT LUẬN
Đề tài “Tổng hợp và đánh giá các đặc tính xúc tác giả enzyme Horseradish
Peroxidase của hệ Hemin biến tính bằng Alginate” sau khi thực hiện thu được các
kết quả như sau:
1. Bằng các phương pháp phân tích hiện đại đã chứng minh hệ AlgHis–He được tổng hợp thành công. Hệ xúc tác AlgHis–He ở các tỷ lệ 1–0,25; 1– 0,5; 1–0,75 và 1–1 có nờng độ He trong mẫu (C %) lần lượt là 11,65 %; 16,89 %; 21,05 % và 22,78 %.
2. Đã đánh giá hoạt lực của hệ xúc tác AlgHis–He của bốn tỷ lệ trên nền Guaiacol, AlgHis–He (1–0,75) có hoạt lực cao nhất trong bốn tỷ lệ (Vmax/Km = 5,7358) và có hoạt lực thấp hơn 4,41 lần so với enzyme HRP (Vmax/Km = 25,2957).
3. Đã đánh giá hoạt tính xúc tác của hệ AlgHis–He trên nền Pyrogallol, AlgHis–He (1–0,75) có hoạt tính ổn định cao hơn enzyme HRP dưới tác động của H2O2 ở nồng độ cao. Ở nồng độ lớn hơn 10 mM, HRP bị mất hoạt tính.
4. Hydrogel được tạo thành trên nền xúc tác AlgHis–He (1–0,75) và hydrogel được tạo thành trên nền xúc tác enzyme HRP thông qua khảo sát thời gian gel hóa cho thấy sự chênh lệch không đáng kể, hydrogel (AlgHis–He) hình thành trong thời gian 25 s, hydrogel (HRP) hình thành trong thời gian 17 s.
60
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Pal K., Banthia A. K. and Majumdar D. K. (2009). “Polymeric hydrogels: characterization and biomedical applications”. Des. Monomers Polym. 12 (3),
pp. 197 – 220.
[2] Roberts J. J., Naudiyal P., Lim K. S., Poole–Warren L. A. and Martens P. J. (2016). “A comparative study of enzyme initiators for crosslinking phenol– functionalized hydrogels for cell encapsulation”. Biomater. Res. 20 (1), pp. 30. [3] Guzik U., Hupert–Kocurek K. and Wojcieszyńska D. (2014). “Immobilization as a strategy for improving enzyme properties–application to oxidoreductases”.
Mol. 19 (7), pp. 9003 – 9010.
[4] Suara A. and Lambeir A. M. (1989). “Kinetics of the reaction of compound II of Horseradish Peroxidase with Hydrogen Peroxide to form compound III”.
Eur. J. Biochcm. 186 (3), pp. 571 – 576.
[5] Inamura I., Isshiki M. and Araki T. (1989). “Solubilization of hemin in neutral and acidic aqueous solutions by forming complexes with water–soluble macromolecules”. Bull. Chem. Soc. Jpn. 62 (7), pp. 2413.
[6] Gharibi H., Moosavi–Movahedi Z., Javadian S., Nazari K. and Moosavi– Movahedi A. A. (2011). “Vesicular Mixed Gemini−SDS−Hemin−Imidazole Complex as a Peroxidase–Like Nano Artificial Enzyme”. J. Phys. Chem. B. 115 (16), pp. 4671 – 4679.
[7] Teng X., Shan J., Yongquan Q., Qiao S., Rui C., Sergey D. and Xiangfeng Duan (2012). “Graphene–Supported Hemin as a Highly Active Biomimetic Oxidation Catalyst”. Angew. Chem. 124 (16), pp. 3888 – 3891.
[8] Qu R., Shen L., Chai Z., Jing C., Zhang Y., An Y. and Shi L. (2014). “Hemin– block copolymer micelle as an artificial Peroxidase and its applications in chromogenic detection and biocatalysis”. ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (21),
pp. 19207 – 19216.
[9] Zhang L., Gu C., Xiong J., Yang M. and Guo Y. (2015). “Hemin–histamine– montmorillonite clay conjugate as a model biocatalyst to mimic natural peroxidase”. Sci. China Chem. 58 (4), pp. 731 – 737.
[10] Amini A. A. and Nair L. S. (2012). “Enzymatically cross–linked injectable gelatin gel as osteoblast delivery vehicle”. J. Bioact. Compat. Polym. 27 (4), pp. 342 – 355.
61 [11] Qin Y. (2004). “Gel swelling properties of alginate fibers”. J. Appl. Polym. Sci.
91 (3), pp. 1641 – 1645.
[12] Maitra J. and Shukla V. K. (2014). “Cross–linking in hydrogels–a review”. Am.
J. Polym. Sci. 4 (2), pp. 25 – 31.
[13] Hoare T. R. and Kohane D. S. (2008). “Hydrogels in drug delivery: Progress and challenges”. Polym. 49 (8), pp. 1993 – 2002.
[14] Angelo C. (2011), “Progress in molecular and environmental bioengineering– from analysis and modeling to technology applications”, Intech, Croatia, pp.
126 – 140.
[15] Tan H. and Marra K. G. (2010). “Injectable, biodegradable hydrogels for tissue engineering applications”. Mater. J. 3 (3), pp. 1754 – 1758.
[16] Ilic–Stojanovic S. S., Nikolic L., Nikolic V., Stankovic M., Stamenkovic J., Mladenovic–Ranisavljevic I. and Petrovic S. (2012). “Influence of monomer and crosslinker molar ratio on the swelling behaviour of thermosensitive hydrogels”. Chem. Ind. Chem. Eng. Q. 18 (1), pp. 1 – 9.
[17] Caló E. and Khutoryanskiy V. V. (2015). “Biomedical applications of hydrogels: A review of patents and commercial products”. Eur. Polym. J. 65,
pp. 255 – 265.
[18] Chai Q., Jiao Y. and Yu X. (2017). “Hydrogels for biomedical applications: their characteristics and the mechanisms behind them”. Gels, 3 (1), pp. 3 – 6. [19] Hoffman A. S. (2012). “Hydrogels for biomedical applications”. Adv. Drug
Delivery Rev. 64, pp. 18 – 23.
[20] Veitch N. C. (2004). “Horseradish peroxidase: a modern view of a classic enzyme”. Phytochem. 65 (3), pp. 249 – 253.
[21] Akbar H., Sedzro D. M., Khan M., Bellah S. F. and Billah S. S. (2018). “Structure, Function and Applications of a Classic Enzyme: Horseradish Peroxidase”. J. Chem. Environ. Biol. Eng. 2 (2), pp. 52 – 59.
[22] Lee F., Bae K. H. and Kurisawa M. (2015). “Injectable hydrogel systems crosslinked by horseradish peroxidase”. Biomed. Mater. 11 (1), pp. 2 – 11. [23] Kurisawa M., Chung J. E., Yang Y. Y., Gao S. J. and Uyama H. (2005).
“Injectable biodegradable hydrogels composed of hyaluronic acid–tyramine conjugates for drug delivery and tissue engineering”. Chem. Commun. (34), pp. 4312 – 4314.
62 [24] Sakai S., Hirose K., Taguchi K., Ogushi Y. and Kawakami K. (2009). “An injectable, in situ enzymatically gellable, gelatin derivative for drug delivery and tissue engineering”. Biomater. 30 (20), pp. 3371 – 3377.
[25] Wang L. S., Chung J. E., Chan P. P. and Kurisawa M. (2010). “Injectable biodegradable hydrogels with tunable mechanical properties for the stimulation of neurogenesic differentiation of human mesenchymal stem cells in 3D culture.” Biomater. 31 (6), pp. 1148 – 1157.
[26] Xu K., Lee F., Gao S. J., Chung J. E., Yano H. and Kurisawa M. (2013). “Injectable hyaluronic acid–tyramine hydrogels incorporating interferon–α2a for liver cancer therapy”. J. Controlled Release. 166 (3), pp. 203 – 210.
[27] Jin R., Hiemstra C., Zhong Z. and Feijen, J. (2007). “Enzyme–mediated fast in situ formation of hydrogels from dextran–tyramine conjugates”. Biomater. 28
(18), pp. 2791 – 2800.
[28] Khanmohammadi M., Dastjerdi M. B., Ahmadi A., Godarzi A., Rahimi A. and Ai J. (2018). “Horseradish peroxidase–catalyzed hydrogelation for biomedical applications”. Biomater. Sci. 6 (6), pp. 1297 – 1298.
[29] Forgiarini E. and Souza A. U. (2007). “Toxicity of textile dyes and their degradation by the enzyme Horseradish Peroxidase (HRP)”. J. Hazard. Mater. 147 (3), pp. 1073 – 1078.
[30] Pradeep N. V., Anupama S., Navya K., Shalini H. N., Idris M. and Hampannavar U. S. (2014). “Biological removal of phenol from wastewaters: a mini review”. Appl. Water Sci. 5 (2), pp. 105 – 112.
[31] Grenoble D. C. and Drickamer, H. G. (1968). “The effect of pressure on the oxidation state of iron. 3. Hemin and hematin”. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 61 (4), pp. 1177.
[32] Bastos E. L., Romoff P., Eckert C. R. and Baader W. J. (2003). “Evaluation of antiradical capacity by H2O2−hemin–induced luminol chemiluminescence”. J.
Agric. Food. Chem. 51 (25), pp. 7481 – 7488.
[33] Jaipan P., Nguyen A. and Narayan R. J. (2017). “Gelatin–based hydrogels for biomedical applications”. MRS Commun. 7 (3), pp. 416 – 426.
[34] Ibrahim Md. Mondal H. (2019), “Cellulose–Based Superabsorbent Hydrogels”,
63 [35] Linh N. T. B., Abueva C. D. G. and Lee B. T. (2017). “Enzymatic in situ formed hydrogel from gelatin–tyramine and chitosan–4–hydroxylphenyl acetamide for the co–delivery of human adipose–derived stem cells and platelet–derived growth factor towards vascularization”. Biomed. Mater. 12 (1), pp. 2 – 10. [36] Hong S., Kim J. S., Jung B., Won C. and Hwang C. (2019). “Coaxial bioprinting
of cell–laden vascular constructs using a gelatin–tyramine bioink”. Biomater. Sci. 7 (11), pp. 4578 – 4587.
[37] Shakeel A. (2019), “Alginates Applications in the Biomedical and Food Industries”, Scrivener, USA, pp. 4 – 15.
[38] Panikkar R. and Brasch D. J. (1996). “Composition and block structure of alginates from New Zealand brown seaweeds”. Carbohydr. Res. 293 (1), pp.
119 – 120.
[39] Saraswathi S. J., Babu B. and Rengasamy R. (2003). “Seasonal studies on the alginate and its biochemical composition I: Sargassum polycystum (Fucales), Phaeophyceae”. Phycol. Res. 51 (4), pp. 240 – 243.
[40] Pawar S. N. and Edgar K. J. (2012). “Alginate derivatization: a review of chemistry, properties and applications”. Biomater. 33 (11), pp. 3283 – 3290. [41] Lagopati N. and Pavlatou E. A. (2020). “Advanced Applications of
Biomaterials Based on Alginic Acid”. Am. J. Biomed. Sci. Res. 9 (1), pp. 49 – 50.
[42] Lee K. Y. and Mooney D. J. (2012). “Alginate: properties and biomedical applications”. Prog. Polym. Sci. 37 (1), pp. 106 – 126.
[43] Orive G., Ponce S., Hernandez R. M., Gascon A. R., Igartua M. and Pedraz J. L. (2002). “Biocompatibility of microcapsules for cell immobilization elaborated with different type of alginates”. Biomater. 23 (18), pp. 3825 – 3826. [44] Qin Y. (2004). “Gel swelling properties of alginate fibers”. J. Appl. Polym. Sci.
91 (3), pp. 1641 – 1645.
[45] Tanzi M. C., Fare S. and Candiani G. (2019), “Foundations of Biomaterials Engineering”, Academic Press, USA, pp. 400 – 412.
[46] Shukla A. and Iravani S. (2019), “Green Synthesis, Characterization and Applications of Nanoparticles”, Elsevier Press, USA, pp. 311 – 315.
[47] Sabu T., Raju T., Zachariah A. K. and Mishra R. K. (2017), “Spectroscopic Methods for Nanomaterials Characterization”, Elsevier Press, USA, pp. 96 –
64 [48] Sabu T., Raju T., Zachariah A. K. and Mishra R. K. (2017), “Thermal and Rheological Measurement Techniques for Nanomaterials Characterization”,
Elsevier Press, USA, pp. 19 – 25.
[49] Latifi A., Sadegh E. and Babavalian H. (2015). “Comparison of Extraction Different Methods of Sodium Alginate from Brown Alga Sargassum sp. Localized in the Southern of Iran”. J. Appl. Biotechnol. Rep. 2 (2), pp. 253 –
255.
[50] Gomez C. G., Lambrecht M. V., Lozano J. E., Rinaudo M. and Villar M. A. (2009). “Influence of the extraction–purification conditions on final properties of alginates obtained from brown algae (Macrocystis pyrifera)”. Int. J. Biol. Macromol. 44 (4), pp. 367 – 369.
[51] Konishi A., Takegami S., Akatani S., Takemoto R. and Kitade T. (2017). “Potentiometric and 1H NMR Spectroscopic Studies of Functional Monomer Influence on Histamine–Imprinted Polymer–Modified Potentiometric Sensor Performance”. J. Anal. Bioanal. Tech. 8 (378), pp. 3.
[52] Yan H., Chen X., Li J., Feng Y., Shi Z., Wang X. and Lin Q. (2016). “Synthesis of alginate derivative via the Ugi reaction and its characterization”. Carbohydr.
Polym. 136 (3), pp. 757 – 763.
[53] Badawy M. E., Taktak N. E., Awad O. M., Elfiki S. A. and El–Ela N. E. (2017). “Preparation and characterization of biopolymers chitosan/alginate/gelatin gel spheres crosslinked by glutaraldehyde”. J. Macromol. Sci. Part B Phys. 56 (6), pp. 366 – 367.
[54] Bi J., Tian C., Zhang G. L., Hao H. and Hou H. M. (2020). “Detection of histamine based on gold nanoparticles with dual sensor system of colorimetric and fluorescence”. Foods 9 (3), pp. 310 – 316.
[55] Collado J. A., Tunon I., Silla E. and Ramirez F. J. (2000). “Vibrational dynamics of histamine monocation in solution: an experimental (FT–IR, FT– Raman) and theoretical (SCRF–DFT) study”. J. Phys. Chem. A 104 (10), pp. 2122 – 2129.
[56] Marcelo M. C., Chandia N. P., Clavijo E., Leal D., Matsuhiro B., Osorio‐Román I. O. and Torres S. (2010). “Characterization of sodium alginate and its block fractions by surface‐enhanced Raman spectroscopy”. J. Raman Spectrosc. 41
65 [57] Schmid T., Messmer A., Yeo B. S., Zhang W. and Zenobi R. (2008). “Towards chemical analysis of nanostructures in biofilms II: tip–enhanced Raman spectroscopy of alginates”. Anal. Bioanal.Chem. 391 (5), pp. 1908 – 1916. [58] Kolosovas–Machuca E. S., Cuadrado A., Ojeda–Galván H. J., Ortiz–Dosal L.
C., Hernández–Arteaga A. C. and González, F. J. (2019). “Detection of histamine dihydrochloride at low concentrations using Raman spectroscopy enhanced by gold nanostars colloids”. J. Nanomater. 9 (2), pp. 3 – 9.
[59] Torreggiani A., Tamba M., Bonora S. and Fini G. (2003). “Raman and IR study on copper binding of histamine”. Biopolymers. 72 (4), pp. 290 – 298.
[60] Collado J. A. and Ramírez F. J. (2000). “Vibrational spectra and assignments of histamine dication in the solid state and in solution”. J. Raman Spectrosc. 31
(10), pp. 925 – 931.
[61] Devi L. G., ArunaKumari M. L., Anitha B. G., Shyamala R. and Poornima G. (2016). “Photocatalytic evaluation of Hemin (chloro (protoporhyinato) iron (III)) anchored ZnO hetero–aggregate system under UV/solar light irradiation: A surface modification method”. Surf. Interfaces. 1, pp. 52 – 58.
[62] Gu C. J., Kong F. Y., Chen Z. D., Fan D. H., Fang H. L. and Wang W. (2016). “Reduced graphene oxide–Hemin–Au nanohybrids: Facile one–pot synthesis and enhanced electrocatalytic activity towards the reduction of hydrogen peroxide”. Biosens. Bioelectron. 78, pp. 300 – 307.
[63] Boffi A., Das T. K., Della S., Spagnuolo C. and Rousseau D. L. (1999). “Pentacoordinate hemin derivatives in sodium dodecyl sulfate micelles: model systems for the assignment of the fifth ligand in ferric heme proteins”. Biophys.
J. 77 (2), pp. 1145.
[64] Atkins P. and Paula J. (2010), “Physical Chemistry”, Oxford University Press, England, pp. 878 – 883.
[65] Taylor T. and Alasalvar C. (2012), “Quality, Technology and Nutraceutical Applications”, Springer, Heidelberg, pp. 91 – 99.
[66] Jang S., Park J. S., Won Y. H., Yun S. J. and Kim S. J. (2012). “The expression of Toll–like receptors (TLRs) in cultured human skin fibroblast is modulated by histamine”. Chonnam Med. J. 48 (1), pp. 7 – 14.
66
PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Kết quả đo phổ 1H–NMR
67
Phụ lục 3. Kết quả FT–IR của AlgHis
68
Phụ lục 5. Kết quả FT–IR của AlgHis–He 1–0,25
69
Phụ lục 7. Kết quả FT–IR của AlgHis–He 1–0,75
70
71
72
73
Phụ lục 12. Hoạt lực của AlgHis–He (1–0,5) trên Guaiacol
74
75
76
77
78
Phụ lục 17. Hiệu suất tổng hợp của AlgHis–He
Tỷ lệ AlgHis– He Nồng độ mẫu đo (ppm) Nồng độ He lý thuyết (ppm) Nồng độ He trung bình thực tế (ppm) Độ hấp thụ trung bình ở bước sóng 385,5 nm Nồng độ He trong AlgHis–He TB C (%) Hiệu suất gắn He TB H (%) 1–0,25 25 5,000 2,912 0,341 11,65 ± 0,06 58,24 ± 0,31 1–0,50 25 8,333 4,223 0.487 16,89 ± 0,28 50,68 ± 0,84 1–0,75 25 10,714 5,262 0,603 21,05 ± 0,13 49,11 ± 0,30 1–1,00 25 12,500 5,695 0.652 22,78 ± 0,06 45,56 ± 0,12
Phụ lục 18. Khảo sát thời gian gel hóa theo hàm lượng AlgHis–He
STT Tỷ lệ AlgHis–He Hàm lượng Gel–Tyr (%) Hàm lượng AlgHis–He (%) Hàm lượng H2O2 (%) Thời gian gel hóa (s) 1 1–0,75 15 0,1 0,04 25 ± 2 2 0,08 31 ± 2 3 0,06 123 ± 3 4 0,04 432 ± 5 5 0,02 Không tạo gel
79
Phụ lục 19. Kết quả khảo sát thời gian gel hóa theo hàm lượng H2O2
STT Tỷ lệ AlgHis–He Hàm lượng Gel–Tyr (%) Hàm lượng AlgHis–He (%) Hàm lượng H2O2 (%) Thời gian gel hóa (s) 1 1–0,75 15 0,1 0,04 25 ± 2 2 0,03 37 ± 2 3 0,02 54 ± 3 4 0,01 196 ± 4 5 0,005 Không tạo gel
Phụ lục 20. Kết quả đánh giá khả năng tạo gel của AlgHis–He (1–0,75), enzyme HRP và He–Na STT Xúc tác Hàm lượng Gel–Tyr (%) Hàm lượng xúc tác (%) Hàm lượng H2O2 (%) Thời gian gel hóa (s) 1 AlgHis–He (1–0,75) 15 0,1 0,04 25 ± 3 2 HRP 17 ± 2 3 He–Na 70 ± 3