Tèi thiÓu 7.0mm
2.5.4.1. Kiểm tra vi khuẩn vàn ấm
- Số lượng vắc xin cần cho một lần thực hiện thử nghiệm vô trùng: 20 lọ. Số lượng vắc xin cần cho kiểm tra vô trùng của một loạt sản xuất được tính theo số lượng sản xuất của loạt đó và thể tích vắc xin có trong mỗi lọ. Số lượng này được WHO, Dược điển Châu Âu, Dược điển Mỹ qui định [130].
Cách lấy mẫu: Lấy ngẫu nhiên để đại diện cho toàn bộ loạt vắc xin và ở những thời điểm có nguy cơ lây nhiễm cao nhất, ở đầu, giữa, cuối giai đoạn đóng ống hoặc ở bất cứ thời điểm tạm ngừng làm việc nào.
Bảng 2.2: Số lọ vắc xin cần lấy từ mỗi loạt để kiểm tra vô trùng vi khuẩn, nấm [130],[131],[133]
Số lượng thành phẩm
của một loạt (Lọ)
Số lượng (Lọ)
Lượng vắc xin trong
mỗi lọ ≥ 2 mL
Lượng vắc xin trong
mỗi lọ < 2 mL < 100 10% nhưng khơng ít hơn 4 20% nhưng khơng ít hơn 8 ≥ 100 và < 500 Ít nhất 10 Ít nhất 20 ≥ 500 Ít nhất 20 Ít nhất 40
Từ năm 2009 đến năm 2013 POLYVAC sản xuất MVVAC với công suất mỗi loạt 30264 lọ (13 giá, mỗi giá 6 khay, mỗi khay 338 lọ), lớn hơn 500 lọ. MVVAC có thể tích mỗi lọ 5,5 mL, lớn hơn 2 mL. Theo quy định của WHO (Bảng 2.2), số lọ dùng cho kiểm tra vô trùng phát hiện vi khuẩn và nấm
- Quy trình thực hiện: + Hồi chỉnh vắc xin.
+ Dùng một bơm chân không hút tất cả vắc xin trong các lọ mẫu cần kiểm tra đi qua một màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,22 µm.
+ Rửa màng lọc để loại bỏ hết các chất ức chế bằng cách cho các dung dịch rửa đi qua.
+ Cắt đôi màng lọc. Nuôi cấy 2 nửa màng lọc trong hai ống môi trường: Một ống môi trường lỏng thioglycolat (Fluid Thioglycollate Medium: FTM) để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn kỵ khí, một ống môi trường canh thang đậu tương (Soybean Casein Digest Broth: SCDB) để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và nấm.
+ Ủ FTM ở nhiệt độ 30-350C ít nhất 14 ngày, SCDB ở nhiệt độ 20- 250C ít nhất 14 ngày.
- Chứng âm:
+ Tính vơ trùng của hai mơi trường FTM và SCDB: Đánh giá bằng thử nghiệm kiểm tra vô trùng hai môi trường này.
+ Mức độ sạch của không gian nơi thực hiện thử nghiệm (Environmental monitoring): Đánh giá bằng việc giám sát môi trường theo các nội dung:
* Đếm số lượng hạt bụi trong khơng khí bằng máy đếm hạt bụi,
* Đếm số lượng vi khuẩn và nấm trong khơng khí bằng 2 phương pháp: Phương pháp thụ động bằng cách đặt các đĩa thạch ở các vị trí có khả năng lây nhiễm khác nhau trong suốt quá trình thực hiện thử nghiệm.
Phương pháp chủ động: Dùng máy lấy mẫu khơng khí để hút khơng khí qua máy. Vi khuẩn và nấm trong khơng khí sẽ gắn vào màng gelatin lắp sẵn trong máy. Đặt màng gelatin lên đĩa thạch. Ủ các đĩa thạch trong tủ ấm. Đếm số khuẩn lạc trên đĩa thạch. Dựa vào vận tốc lấy mẫu, thời gian lấy mẫu để tính số vi khuẩn và nấm có trong mỗi mét khối khơng khí.
Hình 2.6: Đầu thu mẫu máy đếm vi khuẩn và nấm trong khơng khí
* Giám sát vi khuẩn và nấm trên găng tay của cán bộ thực hiện thử nghiệm: Mỗi kỹ thuật viên dùng một đĩa thạch riêng biệt, in 10 đầu ngón tay của mình vào đĩa thạch theo trình tự tay phải in trước, tay trái in sau, tay phải ở giữa đĩa thạch, tay trái bao phía ngồi.
Hình 2.7: Kiểm tra găng của kỹ thuật viên
* Xác định vi khuẩn và nấm trên bề mặt nơi thực hiện thử nghiệm vô trùng: Lấy đĩa thạch tiếp xúc có đường kính 56 mm, mở nắp đĩa thạch và cho mặt thạch tiếp xúc với bề mặt cần kiểm tra trong giây lát. Đóng nắp đĩa thạch. Ủ đĩa thạch trong tủ ấm. Đếm số khuẩn lạc trên đĩa thạch.
- Chứng dương: Thử nghiệm kiểm tra dinh dưỡng môi trường. Thử nghiệm được thực hiện bằng cách cho từ 10-100 CFU (Colony Forming Unit: Khuẩn lạc) chủng thử thách vào mỗi ống môi trường. Nuôi cấy ở nhiệt độ 30-350C đối với các ống cấy vi khuẩn, 20-250C đối với các ống cấy nấm. Môi trường đạt yêu cầu về khả năng cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn và nấm phát triển nếu sau 3 ngày có dấu hiệu vi khuẩn phát triển và sau 5 ngày có dấu hiệu nấm phát triển.
Đối với môi trường FTM, dùng 4 chủng B. subtilis ATCC 6633, K.
rhizophila ATCC 9341, C. albicans ATCC 10231, C. sporogens ATCC 11437 (ít nhất 1 chủng hiếu khí và 1 chủng kỵ khí theo yêu cầu WHO). Đối với môi trường SDCB, dùng 3 chủng B. subtilis ATCC 6633, K. rhizophila
ATCC 9341, C. albicans ATCC 10231 (ít nhất 1 chủng hiếu khí và 1 chủng nấm theo yêu cầu WHO).
Kiểm tra số lượng chủng thử thách đã cấy vào mỗi ống mơi trường xem có đúng từ 10-100 CFU bằng cách cấy đếm khuẩn lạc trên thạch đĩa.
- Tiêu chuẩn đánh giá thử nghiệm vô trùng vắc xin: Vắc xin đạt yêu cầu về vô trùng đối với vi khuẩn và nấm nếu khơng có dấu hiệu mọc của vi khuẩn và nấm trong các ống môi trường cấy màng lọc.