- Được chẩn đoỏn xỏc định là ung thư biểu mụ đại tràng hoặc trực tràng bằng xột nghiệm mụ bệnh học.
-Khối u và tất cả cỏc hạch được xột nghiệm mụ bệnh học đầy đủ.
- Cú đầy đủ cỏc khối nến chứa bệnh phẩm đủ để làm xột nghiệm hoỏ mụ miễn dịch.
-Cú đầy đủ hồ sơ lưu trữ.
2.1.2. Tiờu chuẩn loại trừ
- Những bệnh nhõn được chẩn đoỏn ung thư đại tràng hoặc trực tràng trờn bệnh phẩm sinh thiết nội soi.
- Bệnh nhõn bị ung thư từ cỏc cơ quan khỏc di căn đến đại trực tràng - Cỏc ung thư đại tràng tỏi phỏt, đó được điều trị hoỏ chất và tia xạ tiền phẫu. - Những bệnh nhõn khụng cú đầy đủ hồ sơ bệnh ỏn lưu trữ.
2.2. Cỡ mẫu và phương phỏp chon mẫu
- Cỡ mẫu: gồm 174 bệnh nhõn.
- Chọn mẫu: chọn mẫu cú chủ đớch, bệnh nhõn được chẩn đoỏn xỏc định là ung thư biểu mụ đại trực tràng bằng mụ bệnh học tại khoa giải phẫu bệnh Bệnh viện K Hà Nội và Bệnh viện đa khoa Trớ Đức.
2.3. Địa điểm và thời gian nghiờn cứu 2.3.1 Địa điểm 2.3.1 Địa điểm
- Bệnh viện K Hà Nội.
- Bệnh viện đa khoa Trớ Đức Hà Nội.
- Trung tõm nghiờn cứu và phỏt hiện sớmung thư Hà Nội.
2.3.2. Thời gian nghiờn cứu.
Từ thỏng 10/2010 đến thỏng 5/2014.
2.4. Phương phỏp nghiờn cứu
Phương phỏp nghiờn cứu là mụ tả cắt ngang, hồi cứu
2.4.1 Nghiờn cứu mụ học
2.4.1.1 Phõn loại mụ học
Tất cả cỏc trường hợp đều được nghiờn cứu dựa trờn cỏc tiờu bản cắt từ khối paraffin với cỏc bệnh phẩm đó được cố định bằng formol 10%, xử lý theo quy trỡnh mụ học thụng thường và đều được chẩn đoỏn là ung thư biểu mụ đại trực tràng dựa trờn tiờu bản nhuộm Hematoxylin - Eosin,
Đọc kết quả và phõn loại mụ bệnh học theo phõn loại của Tổ chức Y tế Thế giới năm 2000.
Bảng 2.1. Phõn loại UTBM ĐTT theo WHO 2000
Typ mụ bệnh học Mó ICD-O
Ung thư biểu mụ tuyến 8140/3
Ung thư biểu mụ tuyến nhầy 8480/3
Ung thư biểu mụ tế bào nhẫn 8490/3
Ung thư biểu mụ tế bào nhỏ 8041/3
Ung thư biểu mụ tế bào vảy 8070/3
Ung thư biểu mụ tuyến vảy 8560/3
Ung thư biểu mụ tủy 8510/3
Ung thư biểu mụ khụng biệt húa 8020/3
Ung thư biểu mụ - carcinoid hỗn hợp 8244/3 Cỏc loại khỏc
2.4.1.2. Tiờu chuẩn chẩn đoỏn mụ học
Ung thư biểu mụ tuyến
+ U cú cỏc tuyến trung bỡnh đến lớn với sự thay đổi vừa phải của kớch thước và hỡnh dạng tuyến
+ Trong những u biệt húa cao, cỏc tế bào biểu mụ thường cao và hỡnh trụ và trở nờn hỡnh khối vuụng và đa diện nhiều hơn với mức độ biệt húa giảm dần.
+ Cỏc lũng tuyến chứa chất nhầy ưa eosin cụ đặc và những mảnh vụn nhõn và tế bào (cỏi gọi là hoại tử bẩn).
Ung thư biểu mụ nhầy
Ung thư biểu mụ nhầy được chẩn đoỏn theo mức độ chất nhầy ngoài tế bào là nhữn u bao gồm ≥ 50% là chất nhầy.
Cỏc ung thư biểu mụ nhầy cú chứa ớt nhất lớp biểu mụ phủ từng phần hoặc cú biểu mụ bong ra bơi tự do trong chất nhầy.
Cũng cú thể thấy một số lượng thay đổi cỏc tế bào nhẫn, nhưng dưới 50% u bao gồm cỏc tế bào nhẫn.
Ung thư biểu mụ tế bào nhẫn
+ U phỏt triển dưới dạng lan tỏa, với ớt hoặc khụng hỡnh thành bất kỳ cấu trỳc tuyến nào
+ Hầu hết hoặc tất cả chất nhầy là trong tế bào, trỏi với hỡnh thỏi chất nhầy ngoài tế bào trong ung thư biểu mụ tuyến nhầy.
+ Phải cú >50% tế bào u là tế bào nhẫn.
+ Sự tớch lũy chất nhầy trong tế bào gõy hậu quả đẩy lệch nhõn về một phớa tạo nờn hỡnh nhẫn điển hỡnh của tế bào.
+ Một phõn nhúm của cỏc tế bào nhẫn hỡnh trũn và cú nhõn khu trỳ ở trung tõm, khụng cú hốc chất nhầy rừ rệt.
Ung thư biểu mụ tế bào nhỏ
Ung thư biểu mụ tế bào nhỏ cú hỡnh thỏi học giống ung thư biểu mụ tế bào nhỏ của phổi.
Ung thư biểu mụ tế bào vảy
Hỡnh ảnh bệnh học tương tự như của ung thư biểu mụ vảy ở cỏc cơ quan khỏc.
Chẩn đoỏn ung thư biểu mụ tế bào vảy đũi hỏi (1) loại trừ di căn từ những vị trớ khỏc (đặc biệt là phổi); (2) loại trừ một đường dũ kết hợp được phủ bởi biểu mụ vảy (thường giống vị trớ nguồn gốc); và (3) phõn biệt với những ung thư biểu mụ của hậu mụn lan tràn gần vào trực tràng thấp.
Ung thư biểu mụ tuyến vảy
Cỏc u bất thường này cú những hỡnh ảnh của cả ung thư biểu mụ vảy và ung thư biểu mo tuyến, hoặc như những thành phần riờng biệt trong u hoặc hỗn hợp với nhau.
Để một tổn thương được xếp loại là ung thư biểu mụ tuyến vảy, cần phải cú nhiều hơn cỏc ổ biệt húa vảy nhỏ được tỡm thấy ngẫu nhiờn.
Ung thư biểu mụ khụng biệt húa
Ung thư biểu mụ khụng biệt húa là những ung thư cú bằng chứng biệt húa biểu mụ nhưng khụng hỡnh thành tuyến rừ rệt hoặc những u với một tỷ lệ nhỏ (< 5%) hỡnh thành tuyến.
Cỏc u cú thể tạo thành những dải tế bào, những dõy hoặc những cấu trỳc bố và thường cú hỡnh thỏi phỏt triển xõm nhập.
Một số u cú hỡnh thỏi tế bào học tương đối đồng đều, trong khi những trường hợp khỏc cú thể cú biến đổi của nhõn rừ rệt.
Ung thư biểu mụ tủy
Ung thư biểu mụ tủy bao gồm những dải tế bào đa diện với nhõn hỡnh tỳi, hạt nhõn nổi bật và bào tương rộng, kết hợp với một phản ứng của lympho bào xõm nhập u mạnh.
Cỏc tế bào u cú thể cú cấu trỳc dạng cơ quan hoặc dạng bố và cú thể cú sản xuất chất nhầy thành ổ.
2.4.1.3. Xếp độ biệt húa và độ mụ học
Chỳng tụi xếp độ biệt húa và độ mụ học của ung thư biểu mụ tuyến theo hệ thống xếp độ được sử dụng phổ biến nhất là hệ thống được phờ duyệt bởi Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và AJCC. Độ biệt húa: được chia làm 5 độ và độ mụ học được phõn theo 2 độ thấp và cao.
Bảng 2.2. Xếp độ ung thư biểu mụ tuyến đại trực tràng
Độ Danh phỏp mụ tả Cỏc tiờu chuẩn* Đề nghị của AJCC
GX Độ khụng thể xỏc định
G1 Biệt húa cao > 95% hỡnh thành tuyến Độ thấp Phần lớn (> 75%) cỏc
tuyến nhẵn và đều
Khụng cú thành phần nhõn độ cao cú ý nghĩa G2 Biệt húa trung gian 50%-95% hỡnh thành
tuyến
Độ thấp G3 Kộm biệt húa < 50% hỡnh thành tuyến Độ cao G4 Khụng biệt húa Khụng hỡnh thành**
tuyến rừ rệt
Độ cao
* Tất cả cỏc tiờu chuẩn phải đầy đủ
** Cỏc u khụng biệt húa là một thứ typ riờng
Ngoài cỏc tiờu chuẩn được nờu trờn, việc phõn độ biệt húa cũn dựa theo cỏc đặc điểm hỡnh thỏi học dưới đõy dựa trờn sự sắp xếp của cỏc tế bào cựng với sự hỡnh thành ống:
+ Ung thư độ I: bao gồm chủ yếu những ống tuyến đơn, trong đú cực tớnh của nhõn dễ dàng nhận biết và nhõn cú kớch thước đều. Cú sự giống rừ rệt với biểu mụ của u tuyến.
+ Ung thư độ II: bao gồm những ống tuyến cú thể đơn, phức hợp hoặc khụng đều nhẹ trong đú cực tớnh của nhõn đủ độ để nhận biết rừ hoặc mất cực tớnh.
+ Ung thư độ III: cú đặc điểm hỡnh thỏi là khụng hỡnh thành tuyến, hỡnh thỏi đặc chiếm ưu thế, cũng như mất cực tớnh của nhõn. Để xỏc định một ung thư biểu mụ đại trực tràng, thành phần kộm biệt húa phải tạo thành trờn 50% u, khụng phải chỉ là những ổ hiếm gặp của u.
+ Ung thư biểu mụ khụng biệt húa: là những u biểu mụ ỏc tớnh khụng cú cấu trỳc tuyến hoặc những hỡnh ảnh khỏc chứng tỏ sự biệt húa chắc chắn.
2.4.2 Nghiờn cứu húa mụ miễn dịch
2.4.2.1. Phương phỏp nghiờn cứu
Phương phỏp nhuộm hoỏ mụ miễn dịch được thực hiện trờn cỏc lỏt cắt mụ vựi nến bằng bằng kỹ thuật enzym Avidin Biotin Complex (ABC).
Bộ c l ộ Bộ c l ộ ––Kết h ợ p Kết h ợ p ––Kh uy ếc h đạ iKh uy ếc h đạ i Kh Khááng thể ng thể IIII gắn biotin gắn biotin Kh Khááng thể ng thể II Kh
Khááng nguyng nguyênên Biotin Biotin Avidin Avidin Men Men Bệnh phẩm
Bệnh phẩm đưđượ c cố ợ c cố đđịnh formolịnh formol
Bảng 2.3. Cỏc khỏng thể sử dụng trong nghiờn cứu
Tờn khỏng thể Hóng sản xuất Nồng độ
Monoclonal Mouse Anti-Human CK7 Clone OV-TL-1200
Dako 1/100
Monoclonal Mouse Anti-Human CK20 Clone Ks 20.8
Dako 1/100
Monoclonal Mouse Anti-Human p53 protein Clone DO-7
Dako 1/100
Monoclonal Mouse Anti-Human Ki-67 antigen Clone MIB-1
Dako 1/100
Polyclonal Rabit Anti-Human C-erbB-2 Oncoprotein
Dako 1/100
Polyclonal Rabit Anti-Human MUC-1 Clone Ab15418
Dako 1/100
Monoclonal Mouse Anti-Human MUC-2 Clone CCP58
Dako 1/25
Rabit Monoclonal Antibody Cytokeratin 19 A53-B/A2.26
Cell marquer 1/100
Rabit Monoclonal Antibody CDX-2 EPR2764Y
Cell marquer 1/100
2.4.2.2 Quy trỡnh xử lý tiờu bản hoỏ mụ miễn dịch
Quy trỡnh xử lý tiờu bản hoỏ mụ miễn dịch theo cỏc bước sau: - Sử dụng kỹ thuật Biotin - Avidin Complex (ABC).
1.Bệnh phẩm được cắt dày 4m, dàn trờn cỏc lam kớnh phủ silane. 2. Ủ qua đờm ở nhiệt độ 56C.
4.Rửa nước x 5 phỳt.
5.Bộc lộ khỏng nguyờn bằng nhiệt: đặt tiờu bản trong dung dịch citrate nồng độ 0,01mol/l, pH = 6,0, đun sụi trong nồi ỏp suất x 5 phỳt.
6.Rửa nước cất x 5 phỳt.
7.Khử peroxidase nội sinh bằng H2O2 x 10 phỳt. 8.Rửa nước cất x 5 phỳt. 9. Ủ khỏng thể thứ nhất 1 giờ. 10.Rửa TBS 3 lần, mỗi lần 5 phỳt. 11. Ủ khỏng thể thứ hai 30 phỳt. 12.Rửa TBS 3 lần, mỗi lần 5 phỳt 13.Phủ ABC x 30 phỳt 14.Rửa TBS 3 lần x 5 phỳt 15. Ủ với DAB x 10 phỳt. 16.Rửa nước chảy x 5 phỳt.
17.Nhuộm nhõn với Hematoxylin x 30 giõy. 18.Tẩy nước, phủ lamen.
Kết quả nhuộm
Âm tớnh: chỉ cú màu xanh tớm của Hematoxylin nhuộm nhõn.
Dương tớnh: nếu cú hiện diện khỏng nguyờn trờn tế bào sẽ cú màu vàng nõu.
2.4.2.3. Điều kiện đọc kết quả
+ Cú tiờu bản chứng õm (trong quỏ trỡnh nhuộm bỏ qua giai đoạn phủ khỏng thể thứ nhất) và chứng dương (nhuộm kốm với tiờu bản mụ đó biết chắc chắn là dương tớnh), cú thể dựng chứng dương ngay trong tiờu bản nhuộm, được gọi là nội chứng.
+ Phải đối chiếu với tiờu bản nhuộm HE để biết vựng cần đọc kết quả là vựng nào.
+ Biết rừ vị trớ khỏng nguyờn cần xỏc định ở nhõn, bào tương hay màng tế bào.
2.4.2.4. Cỏch đọc kết quả
- Bộc lộ CK7, CK19 và CK20
Phản ứng dương tớnh thể hiện bằng màu nõu đỏ ở bào tương tế bào ở ≥ 10% tế bào.
- Bộc lộ CDX-2
Dựa vào cường độ bắt màu của nhõn và tỷ lệ cỏc tế bào dương tớnh. Biểu hiện dương tớnh khi nhõn tế bào cú màu vàng nõu. Phản ứng dương tớnh nếu trờn 10% nhõn tế bào bắt màu với cường độ đủ nhận thấy dưới kớnh hiển vi quang học
- Bộc lộ MUC-1
MUC-1 dương tớnh khi cú màu nõu đỏ của chất nhầy trong lũng tuyến, dạng màng ở cực đỉnh tế bào và bào tương tế bào. MUC-2 cú màu nõu đỏ ở bào tương tế bào.
- Bộc lộ MUC-2
MUC-2 dương tớnh khi cú màu nõu đỏ ở bào tương tế bào.
- Bộc lộ p53
Dựa vào cường độ bắt màu của nhõn và tỷ lệ cỏc tế bào dương tớnh. Biểu hiện dương tớnh khi nhõn tế bào cú màu nõu đỏ, kết quả õm tớnh khi nhõn tế bào khụng bắt màu vàng nõu. Phản ứng dương tớnh nếu trờn 10% nhõn tế bào bắt màu với cường độ đủ nhận thấy dưới kớnh hiển vi quang học
- Bộc lộ Ki-67
Biểu hiện dương tớnh khi nhõn tế bào cú màu nõu đỏ, kết quả õm tớnh khi nhõn tế bào khụng bắt màu nõu đỏ. Phản ứng dương tớnh nếu trờn 10% nhõn tế bào bắt màu với cường độ đủ nhận thấy dưới kớnh hiển vi quang học
- Bộc lộ của Her-2/neu
Kết quả dương tinh đối với Her -2/neu được đỏnh giỏ theo tiờu chuẩn của nhà sản xuất Dako.
Sử dụng khỏng thể đa dũng khỏng Her -2/neu, pha loóng 1/200.
Sử dụng mụ đại tràng lành, vựng cạnh u làm chứng õm, sử dụng một tiờu bản đó chắc chắn là dương tớnh là chứng dương
Đọc tiờu bản trờn kớnh hiển vi quang học để đỏnh giỏ cường độ bắt màu của màng bào tương và tớnh tỷ lệ cỏc tế bào dương tớnh với Her-2/neu.
Phản ứng dương tớnh ở màng tế bào và được chia làm bốn mức: õm tớnh, 1+, 2+ và 3+. Phản ứng chỉ được coi là dương tớnh thực sự ở mức 3+.
Bảng dưới đõy là thang điểm đỏnh giỏ kết quả nhuộm Her-2/neu
Bảng 2.4. Thangđiểm đỏnh giỏ kết quả nhuộm Her-2/neu trờn HMMD Thang điểm Đỏnh giỏ sự biểu Thang điểm Đỏnh giỏ sự biểu
lộ protein HER2 Bệnh phẩm phẫu thuật
0 Âm tớnh Khụng phản ứng hoặc nhuộm màng <10% tế bào u
1+ Âm tớnh Nhuộm nhạt màng bào tương >10% cỏc tế bào u, cỏc tế bào chỉ nhuộm một phần màng bào tương
2+ Nghi ngờ Nhuộm yếu- vừa, hoàn toàn đỏy bờn hoặc bờn màng tế bào≥ 10% tế bào u.
3+ Dương tớnh Nhuộm đậm, hoàn toàn đỏy bờn hoặc bờn màng tế bào ≥ 10% tế bào u.
2.5. Cỏc chỉ tiờu nghiờn cứu2.5.1. Đặc điểm tuổi và giới 2.5.1. Đặc điểm tuổi và giới
Tuổi: tớnh bằng năm và được phõn thành:
- Cỏc nhúm cỏch nhau 10 tuổi. So sỏnh tỷ lệ mắc bệnh giữa cỏc nhúm tuổi, đặc biệt nhúm < 40 và nhúm ≥ 40 tuổi.
Giới: so sỏnh tỷ lệ mắc bệnh giữa nam và nữ.
2.5.2. Cỏc đặc điểm của khối u
- Độ xõm lấn của khối u: được xếp theo cỏc mức Tis, T1, T2, T3, T4 theo độ xõm lấn tăng dần:
+ Tis: u ở lớp biểu mụ.
+ T1: u xõm lấn tới lớp dưới niờm mạc. + T2: u xõm lấn vào lớp cơ.
+ T3: u xõm lấn qua lớp cơ vào lớp dưới thanh mạc hoặc vào mụ quanh đại tràng hay mụ quanh trực tràng.
+ T4: u làm thủng lớp phỳc mạc tạng hay xõm lấn trực tiếp vào cơ quan hoặc cấu trỳc khỏc.
- Tỡnh trạng hoại tử tổ chức u. - Tỡnh trạng xõm nhập viờm. - Tỡnh trạng xõm nhập mạch.
2.5.3. Giai đoạn bệnh
Trờn cơ sở hệ thống phõn loại TNM bệnh nhõn sẽ được chuyển đổi sang hệ thống phõn loại Dukes như sau:
Bảng 2.5. Phõn giai đoạn ung thư biểu mụ đại trực tràng Phõn loại Dukes Phõn loại theo hệ Phõn loại Dukes Phõn loại theo hệ
thống TNM Tiờu chuẩn
A I T1 hoặc T2, N0, M0
B II T3 hoặc T4, N0, M0
C III Mọi T, N1 hoặc N2, M0
D IV Mọi T, mọi N, M1
2.5.4. Phõn loại di căn hạch
Theo hệ thống TNM, di căn hạch được chia làm 3 mức dựa vào số lượng hạch di căn và ký hiệu bằng chữa in hoa là N0, N1, N2.
No: khụng cú di căn hạch N1: di căn vào 1 đến 3 hạch N2: di căn ≥ 4 hạch
2.5.5. Cỏc chỉ tiờu mụ học
- Phõn loại mụ bệnh học: dựa theo phõn loại của tổ chức Y tế thể giới năm 2000.
- Độ biệt húa: được chia làm 5 độ và độ mụ học được phõn theo 2 độ thấp và cao theo Compton và CS (2000) và Greene và CS (2002).
- Đỏnh giỏ tỡnh trạng xõm nhập thành ruột, xõm nhập lympho-tương bào, xõm nhập mạch, và hoại tử uđỏm lớn qua mẫu bệnh phẩm UT ĐTT.
- Đỏnh giỏ tỡnh trạng di căn hạch qua sinh thiết hạch làm giải phẫu bệnh.