Chương 3 : PHƯƠNG PHÁP TIN HÀNH
3.5.3 Phương pháp thí nghi m
T i cơ s% chăn nuôi heo: quan sát, thu th p và ghi nh n nh ng thông tin v ngu n
m u.
T i phòng xét nghi m: th c hi n xét nghi m
3.5.3.1 Quy trình xét nghi(m nhóm ββββ-agonist và diethylstilbetrol (DES)
Bư c 1: Phân tích sàng l c b ng ELISA Chu"n b m u
Chu"n b m u nư c ti u ñ xét nghi m ß-agonist và DES 1. Ly tâm 0,5ml m u nư c ti u 4000 vòng/phút trong 5 phút.
2. L y 50µl ph n nư c trong bên trên cho vào m'i gi ng thí nghi m.
Chu"n b m u th c ăn gia súc đ xét nghi m ß-agonist 1. Đ ng nh t m u v i máy tr!n thích h p.
2. Thêm 8ml acetonitrite và 1ml ethyl acetate cho 1,5g m u. L*c trong 3 phút b ng vortex % t c ñ! t i đa.
3. Ly tâm 4000 vịng/phút trong 5 phút % nhi t đ! phịng (20-25oC). Sau đó l y 6ml ph n nư c n@i bên trên cho vào 1 ng nghi m m i.
4. Làm khô m u b ng cơ quay chân khơng trong b p đun cách th y % 60-70oC.
5. Thêm 1ml hexan ñ hồ tan m u sau đó thêm 1ml 1xPBS, l*c trong 1 phút b ng vortex % t c ñ! t i ña.
6. Ly tâm m u 4000 vịng/phút trong 5 phút. S& d ng 50µl nư c % l p dư i cho thí nghi m.
Chu"n b m u th c ăn gia súc ñ xét nghi m Diethylstilbetrol (DES) 1. Đ ng nh t m u v i máy tr!n thích h p
2. Cân ra 2g m u ñã ñư c ñ ng nh t và tr!n v i 8ml ethyl acetate. L*c trong 3 phút b ng vortex % t c ñ! t i ña.
3. Ly tâm 4000 vịng/phút trong 5 phút % nhi t đ! phịng (20-25oC).
4. L y 4ml ph n ethyl acetate n@i bên trên (tương ng v i 1g m u th c ăn ban
ñ u) vào 1 l m i và s& d ng cô quay chân không làm khô m u trong b p đun
cách th y % 60-70oC.
5. Hồ tan ph n đã dư c làm khơ b ng 2ml n-hexan.
6. Thêm 1ml 1xPBS-methanol solution vào m u và l*c trong 2 phút b ng vortex % t c ñ! t i ña.
7. Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút % nhi t đ! phịng. B? ñi l p n-hexan %
bên trên.
8. S& d ng 50µl l p ch t l?ng phía bên dư i cho vào m'i gi ng cho thí nghi m. Các bư c th c hi n test phát hi n β-agonist và DES trong m u th c ăn và nư c ti u
1. Cho dung d ch β-agonist chu"n (ñ i di n là Clenbuterol) hay Diethylstilbetrol chu"n vào 2 gi ng, 50µl m'i gi ng.
2. M'i m u cho vào 2 gi ng, 50µl m'i gi ng.
3. Thêm 100µl antiboby#1 và tr!n đ u b ng cách nhG nhàng ñưa ñĩa qua l i b ng tay trong 1 phút.
4. N đĩa trong 30 phút % nhi t đ! phịng (20-25oC)
5. R&a ñĩa 3 l n v i 250ml 1xWash Solution. Sau l n r&a cu i, l t ngư c đĩa và v' nhG đĩa cho khơ trên gi y th m.
6. Thêm 150µl 1xHRP-Conjugate Antibody#2 cho test phát hi n β-agonist hay
1xAntibody #2 solution cho test phát hi n DES. N ñĩa 30 phút % nhi t ñ! phòng (20-25oC)
7. R&a ñĩa 3 l n v i 250ml 1xWash Solution. Sau l n r&a cu i, l t ngư c ñĩa và v' nhG ñĩa cho khơ trên gi y th m.
8. Thêm 100µl TMB Subtrate. Ph n ng sB x y ra ngay khi thêm ch t n n. Tr!n dung d ch b ng cách nhG nhàng ñưa qua ñưa l i ñĩa b ng tay 1 phút trong khi . 9. Sau khi 15 phút % nhi t đ! phịng (20-25oC), thêm 100µl Stop Buffer đ
ng#ng ph n ng.
10. Đ c ñĩa càng s m càng t t ngay sau khi thêm Stop Buffer lên đĩa v i bư c sóng 450nm.
Cơng th c tính n ng đ! β-agonist và DES
Đ! h p ph tương ñ i (%)
= (Ch t h p ph chu"n hay m u / Đ! h p ph chu"n zero) x 100 Bư c 2: Phân tích hàm lư ng b ng phương pháp s*c ký l?ng ghép kh i ph@ LC/MS (đư c g%i đi phân tích t i Trung tâm ñào t o và phát tri n s*c ký).
Cân b ng nhi t ñ! thu c th& và môi trư ng
(20-25oC) Phân b các dung d ch làm ñ i ch ng lên các microwel 100 µl Antibody #1 Cân 1,5 g m u Vortex trong 3 phút Đ ng nh t m u TĂGS + 1ml hexan, + 1ml 1x PBS Ly tâm 4000 vòng/ phút trong 5 phút L y 0,5 ml nư c ti u 50 µl nư c % l p dư i vào gi ng m u Hút 6 ml N 15 phút, 20-25oC Làm khô m u b ng cô quay chân không
+ 8ml acetonitrile +1ml ethyl acetate
r&a 3 l n m'i l n 250 ml 1xWash solution L*c nhG, 30 phút, 20-25oC Vortex 1 phút Ly tâm 4000 vòng/ phút trong 5 phút Ly tâm 4000 vòng/ phút trong 5 phút
50 µl nư c trong bên trên vào gi ng m u 50 µl dd 1xPBS vào gi ng Blank 50 µl dd Clenbuterol NegativeControl vào gi ng Bo 50 µl các dd Clenbuterol chu"n vào gi ng chu"n 150 µl Antibody #2 L*c nhG, 30 phút, 20-25oC
r&a 3 l n m'i l n 250 ml 1xWash solution 100 µl TMB Subtrate
100 µl Stop Buffer
Đo ELISA % bư c sóng 450 nm Tính tốn k t qu
Cân b ng nhi t đ! thu c th& và mơi trư ng
(20-25oC) Phân b các dung d ch làm đ i ch ng lên các microwel 100 µl Antibody #1 Cân 2g m u Vortex trong 3 phút Đ ng nh t m u TĂGS + 1ml hexan, + 1ml 1x PBS Ly tâm 4000 vòng/ phút trong 5 phút L y 0,5 ml nư c ti u 50 µl nư c % l p dư i vào gi ng m u Hút 4 ml N 15 phút, 20-25oC Làm khô m u b ng cô quay chân không
+ 8ml ethyl acetate
r&a 3 l n m'i l n 250 ml 1xWash solution L*c nhG, 30 phút, 20-25oC Vortex 1 phút Ly tâm 4000 vòng/ phút trong 5 phút Ly tâm 4000 vòng/ phút trong 5 phút
50 µl nư c trong bên trên vào gi ng m u
150 µl Antibody #2 L*c nhG, 30 phút, 20-25oC
r&a 3 l n m'i l n 250 ml 1xWash solution 100 µl TMB Subtrate
100 µl Stop Buffer
Đo ELISA % bư c sóng 450 nm Tính tốn k t qu
Sơ đ4 3.2. Quy trình phân tích Diethylstilbetrol (Theo Bioo Scientific – USA, 2008)
50 µl dd 1xPBS trong Methanon vào gi ng Blank 50 µl các dd Diethylstilbetrol chu"n vào gi ng chu"n 50 µl dd Diethylstilbetrol NegativeControl vào gi ng Bo
3.5.3.2 Quy trình xét nghi(m xác đ%nh aflatoxin trong th)c ăn chăn ni
Bư c 1: Phân tích sàng l c b ng phương pháp s*c ký b n m?ng Chu"n b m u
Phương pháp ly trích
Cân 20g m u đã nghi n k thành b!t <20 mesh vào trong bình tam giác 200ml có nút nhám th y tinh, thêm 10ml nư c ñ làm "m m u. B@ sung 100ml chloroform,
ñ y n*p, l*c 10 phút % t c ñ! nhanh. L c qua gi y l c vào m!t ng đong chia v ch
50ml có nút nhám th y tinh. B@ sung 10g Na2SO4 khan vào 50ml d ch l c, ñ yên và s& d ng cho s*t ký c!t. (AFB1)
Phương pháp tích và tinh ch aflatoxin Chu"n b c!t florisil ñ tinh ch như sau:
Cho vào c!t 5ml chloroform. Ti p theo l n lư t cho vào c!t 5g Na2SO4; 0,7g Florisil và 0,5g Na2SO4.
Chuy n 50ml d ch l c m u vào c!t. N u dịng ch y ch m thì khu y l p Na2SO4 phía trên.
Tráng ng đong b ng m!t ít chloroform và chuy n vào c!t s*t ký.
Khi m c d ch l c h xu ng ñ n l p Na2SO4, tráng thành c!t b ng chloroform và cho ch y qua thành c!t như trên.
Aflatoxin kh?i c!t b ng 30ml h'n h p acetone - nư c (99:1). Thu nh n d ch dung ly vào bình 30ml hình qu lê, làm khơ b ng cơ quay chân khơng trong b p đun cách
th y. hòa tan c2n khô b ng 1ml chloroform, b o qu n và dùng làm phân tích b ng TLC và HPLC.
Các bư c th c hi n test phát hi n aflatoxin trong th c ăn b ng s*c ký b n m?ng Ch m các v t 10-20Ml h@n h p aflatoxin chu"n (B1, 2; B2, 1; G1,2; G1,1 Ml/ml) cách nhau 1,2 cm/ m u lên ñư ng xu t phát (t hình dung ho2c kC b ng bút chì cách c nh dư i b ng TLC 2cm). S y khô b ng m!t qu t nh?. Ti n hành s*c ký b ng h dung môi tri n khai. Đ làm khô b ng TLC 10 phút. Quan sát các v t phát huỳnh quang b ng ñèn 365nm.
Bư c 2: Phân tích hàm lư ng b ng phương pháp HPLC Chu"n b m u
Phương pháp t o d n xu t TFA dùng cho phân tích pha ngư c
Cho 0,2ml m u đã phân tích TLC và h'n h p aflatoxin chu"n vào m!t l nh?,
làm khơ trong lịng khí N2. Dùng micropipette thêm 200 Ml hexan và 50 Ml TFA vào l , l*c ñ u, ñun % 40oC trong 5 phút và làm khơ trong dịng khí N2. Hịa tan c2n khô trong 0,2 ml dung môi acetonitrile-nư c (1:4). B o qu n đ phân tích b ng HPLC.
Phân tích b ng HPLC
S& d ng các thông s li t kê % b ng 1.
Tu n t bơm 10 Ml dung d ch ch t chu"n ñã x& lý b ng TFA và 10 Ml dung d ch m u ñã x& lý v i TFA vào thi t b . N u peak c a m u n m ngồi vùng tuy n tính thì
pha lỗng m u b ng m!t dung d ch thích h p c a dung môi acetonitrile-nư c (1:4) (ho2c cơ đ2c l i), tr!n và n p m u vào máy. Tính lư ng aflatoxin d a vào di n tích c a peak và n ng đ! c a các ch t chu"n.
B2ng 3.1. Đi u ki n phân tích aflatoxin b ng HPLC
C!t C18 Pha ñ!ng Acetonitrile-Methanol- Đ m phosphate 0,2M (21:5:3) Bư c sóng kích thích 365 nm Bư c sóng phát quang 430 nm T c đ! dịng 10ml/phút Nhi t đ! c!t 40oC Tính tốn k t qu : Tính k t qu tr c ti p b ng ph n m m HPLC 2D Chemstation.
Nghi n m u thành b!t m n Cân 20g m u + 10ml nư c + 100ml chloroform L*c 10 phút % t c ñ! nhanh L c qua gi y l c Hút 50ml d ch l c + 10g Na2SO4 khan Cho vào ng ñong, ñ yên
Cho vào c!t TLC l n lư t 5ml chloroform 5g Na2SO4 khan 0,7g Florisil 0,5g Na2SO4 khan Chuy n d ch l c vào c!t Tráng ng ñong b ng 5ml chloroform và chuy n vào c!t Khi d ch l c h xu ng ñ n l p Na2SO4
tráng thành c!t b ng 15ml chloroform Thu dung d ch vào bình qu lê Làm khơ b ng cơ quay chân khơng Hồ tan c2n khơ b ng 1ml chloroform
Cho vào bình nh? b o qu n l nh Ch m v t 10-20Ml h'n h p
AF chu"n và dung d ch m u
Đ khô b n silicagel Ngâm vào h dung môi
khai tri n s*c ký S y khô b n silicagel Quan sát v t phát huỳnh quang b ng ñèn 365 nm TLC HPLC L y 0,2ml dd m u L y 0,2ml dd AF chu"n Làm khơ b ng dịng khí N2 + 200Ml hexan, + 50Ml TFA L*c ñ u Làm khơ b ng dịng khí N2 Đun 40oC, 5 phút
Hồ tan c2n khô trong 0,2Ml dung môi acetonitril-nư c (1:4)
Bơm 10Ml vào máy HPLC Xem k t qu
3.6 Phương pháp x9 lý s# li(u
T l CSCN vi ph m s& d ng β-agonist, DES
T l CSCN vi ph m (%) = ( S CSCN vi ph m / S CSCN kh o sát) x 100 T l m u có t n dư β-agonist, DES
T l m u có t n dư (%) = ( S m u có t n dư / S m u kh o sát) x 100 T l CSCN b nhi m aflatoxin trong th c ăn
T l CSCN nhi m AF (%) = ( S CSCN nhi m AF / S CSCN kh o sát) x 100 T l phân b m u nhi m AF theo m c ñ! nhi m
T l phân b m u theo m c ñ! nhi m AF (%) = (S m u nhi m AF % hàm lư ng X / T@ng s m u nhi m AF) x 100
(X: <50 ppb/ ≥50-100 ppb/ ≥100 ppb)
S li u ñư c thu th p và x& lý theo phương pháp th ng kê sinh h c v i ph n m m Minibtab 12.21 for Windows. Dùng tr*c nghi m χ2 ñ so sánh t l dương tính v i aflatoxin trong các m u th c ăn thu th p.
Chương 4
K T QU VÀ TH O LU N
4.1 TÌNH HÌNH T N DƯ DIETHYLSTILBETROL (DES)
Trong th i gian th c hi n đ tài, chúng tơi ñã ti n hành l y m u t i 30 CSCN heo th t trên ña bàn thành ph H Chí Minh thu!c các qu n 9, 12, Nhà Bè, Bình Tân, Hóc Mơn và C Chi. T@ng s m u th c ăn gia súc thu th p ñư c là 95 m u g m 2 lo i: th c ăn t@ng h p s(n bán trên th trư ng và th c ăn do CSCN heo t tr!n theo cơng
th c riêng; trong đó có 52 m u cám l y t i kho, 43 m u cám l y tr c ti p t i máng.
T@ng s m u nư c ti u ñư c l y t i các ô chu ng heo th t s*p xu t bán là 266 m u. Qua phân tích b ng b! kit ELISA (Bioo Scientific, M ), chúng tôi ghi nh n k t qu v t l t n dư DES % b ng 4.1
B2ng 4.1. T l m u th c ăn và nư c ti u t n dư DES
Lo;i m@u
Đ#i tư.ng
kh2o sát CSCN Cám kho Cám máng Nư c ti<u Qu6n /huy(n N n TA l( (%) N n TA l( (%) N n TA l( (%) N n TA l( (%) Q9 3 0 0,00 4 0 0,00 5 0 0,00 26 0 0,00 Q12 3 0 0,00 5 0 0,00 2 0 0,00 10 0 0,00 Nhà Bè 1 0 0,00 2 0 0,00 0 0 0,00 5 0 0,00 Bình Tân 3 0 0,00 3 0 0,00 0 0 0,00 4 0 0,00 Hóc Mơn 2 0 0,00 4 0 0,00 3 0 0,00 12 0 0,00 C0 Chi 18 0 0,00 34 0 0,00 33 0 0,00 209 0 0,00 T>ng 30 0 0,00 52 0 0,00 43 0 0,00 266 0 0,00
N: s CSCN/m u ñư c thu th p ñư c. n: s CSCN/m u dương tính.
Qua b ng 4.1, chúng tơi ghi nh n ñư c k t qu ban ñ u v tình hình t n dư DES r t kh quan. 30 CSCN heo ñư c kh o sát g m 21 CSCN ñư c s ki m soát thư ng xuyên và ch2t chB c a các cơ quan ch c năng (nhóm CSCN thu!c h p tác xã tiên phong, CSCN an toàn d ch) và 9 CSCN tư nhân ñư c l a ch n ng u nhiên. Các CSCN ng u nhiên ñư c l a ch n chăn nuôi heo % các quy mô khác nhau t# CSCN nh? vài
ch c con ñ n CSCN l n vài ngàn con heo th t và hồn tồn khơng có s ki m soát c a thú y v ngu n th c ăn cho heo. T t c các m u xét nghi m c a các CSCN này ñ u cho k t qu âm tính v i DES. Qua đó có th th y r ng các CSCN ñư c l y m u ñ u tuân th ñúng quy ñ nh c a lu t pháp trong vi c s& d ng DES, lo i kích thích t này h u như khơng có s& d ng trên đa bàn thành ph H Chí Minh. Tuy nhiên vì s lư ng CSCN ñư c l y m u kh o sát cịn ít, ch l y m u ng u nhiên 30 CSCN trên ñ a bàn thành ph , nên k t lu n c a chúng tơi ch có tính tương đ i; đ có k t qu chính xác hơn thì c n tăng s lư ng CSCN ñư c ñi u tra.
Các CSCN đư c kh o sát khơng th y có s& d ng DES, có th m!t ph n do vi c s& d ng DES % M và c!ng ñ ng Châu Âu vào m c đích kích thích tăng trư%ng trong chăn ni vào nh ng năm 1954-1979 ñã gây ra nhi u tai ti ng x u trên th gi i (nhi u nhà khoa h c ñã nghi ng có m i liên h gi a vi c tiêu th th t c a nh ng con v t
dùng DES và m!t vài kh i u c a ngư i, các đ!ng v t thí nghi m ñư c nuôi dư ng b ng th t c a các ñ i gia súc ñư c dùng DES cũng làm tăng các ca ung thư) nên nó đã b c m s& d ng t# r t lâu. Năm 1979, ch t này b*t ñ u b c m hoàn toàn t i M và %
Châu Âu là vào năm 1981. T i Vi t Nam, theo quy t ñ nh s 54/2002/QĐ-BNN ra ngày 20/06/2002 c a b! Nông nghi p và Phát tri n Nông thôn, diethylstilbetrol n m trong danh m c 18 hố ch t và kích thích t b c m s n xu t, nh p kh"u, lưu thông và s& d ng trong s n xu t và kinh doanh th c ăn chăn nuôi.
M!t ph n có th do tác d ng c a DES, khi so sánh ñáp ng tăng tr ng c a DES trên m!t s lồi đ!ng v t thì ngư i ta th y s tăng trư%ng c a gia súc và c#u ñ i v i DES tăng lên rõ r t, % gia c m ch t m th i và % heo thì khơng th y có đáp ng tăng