Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn

2 3 Phương pháp thực nghiệm

233 Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn

2 3 3 1 Đánh giá khả năng kháng khuẩn của AgNPs

Luận án lựa chọn 6 chủng vi khuẩn gây bệnh thường gặp bao gồm 03 chủng gram âm (E coli, P aeruginosa, S enterica) và 03 ch ủng gram dương (S aureus, B

cereus, E faecalis) để đánh giá hoạ t tính kháng khu ẩ n c ủa nano b ạ c t ổng h ợp đượ c

(AgSa, AgCol) Nghiên c ứ u t ổng quan cho th ấy để đánh giá khả năng kháng khuẩ n c ủa AgNPs bằng phương pháp khuế ch tán gi ế ng thạ ch theo CLSI [189] được sử dụng khá phổ biến Phương pháp này phù hợp v ớ i tác nhân kháng khu ẩn theo cơ chế khuế ch tán, th ự c hi ệ n nhanh và k ế t qu ả tr ự c quan Quy trình thực hiện được mơ tả trên Hình 2 15 Các bước tiến hành:

- Các chủng vi khuẩn kiểm nghiệm sau khi được hoạt hóa từ ống chủng gốc trên môi trường LB đặc, một khuẩn lạc được cấy chuyển sang 15 ml, 100 ml môi trường LB lỏng và ni lắc ở 37℃, 150 vịng/phút, 14 - 16 giờ TT Nồng độAgNPs (g/mL) Nồng độ Fib (%) Mức ép (%) Gia nhiệt 70 80 90

1 80 2,5 VisFib@Ag11 VisFib@Ag21 VisFib@Ag31 t = 110

3 ℃, 2 phút

2 40 2,5 VisFib@Ag12 VisFib@Ag22 VisFib@Ag32

-

Đĩa thạch thử hoạt tính được chuẩn bị bằng cách cấy trải 100 µL dịch vi khuẩn kiểm nghiệm (mật độ tương đương 1 - 2 × 108 CFU/ml) lên bề mặt đĩa petri có chứa mơi trường LB đặc, sau đó để đĩa thạch khơ

- -

Dùng dụng cụ đục lỗ vô trùng để đục các giếng thạch đường kính 6 mm Nhỏ 30L dung dịch nano bạc với các nồng độ khác nhau (pha lỗng gấp đơi) vào các giếng Kháng sinh sử dụng làm kiểm chứng dương cần có phổ kháng khuẩn rộng nên luận án chọn 02 loại kháng sinh là Streptomycin (Strep) 30g/ml và Chloramphenicol (Clp) 200g/ml Kiểm chứng âm là nước cất Đĩa kiểm nghiệm được nuôi 37℃, 24h

- Đánh giá khả năng kháng khuẩn bằng cách đo đường kính kháng khuẩn (ZOI) theo cơng thức (2 3)

ZOI (mm) = D - d (2 3)

Trong đó:

D: đường kính vùng ức chế (mm), d: đường kính giếng thạch (mm)

Các thí nghiệm được lặp lại ba lần và lấy giá trị trung bình, thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Chủng kiểm định (4℃) Nuôi trong môi trường

LB lỏng

Trang lên đĩa thạch

Chủng cấy ria trên đĩa thạch giữ ở 4℃

Lấy 1 khuẩn lạc nuôi trong môi trường LB lỏng 15 ml, 100 ml ở 37℃,

150 v/p, 14-16h Trang trên đĩa mật độ 1-2 108 CFU/ml Đục giếng thạch d = 6 mm Nhỏ 30l dung dịch Nhỏ dung dịch kiểm định vào các giếng thạch AgNPs, kiểm chứng dương, âm vào các

giếng thạch Ni ở 37℃, 24h

Xác định đường

kính kháng khuẩn ZOI (mm) = D - d

Hình 2 15: Sơ đồ quy trình đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của AgNPs theo tiêu chuẩn CLSI

2 3 3 2 Đánh giá khả năng kháng khuẩn của vải

Luận án tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của vải theo một số tiêu chuẩn quốc tế và thử nghiệm với chủng vi khuẩn gram âm (E coli, ATCC 8739) và gram dương (S aureus, ATCC 25923) Hai chủng vi khuẩn này được lựa chọn để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của vải do đây là 2 chủng vi khuẩn đặc trưng cho 2 nhóm vi

khuẩn gram âm và gram dương [190] Đây cũng là 2 chủng vi khuẩn phổ biến, thường gây bệnh qua đường tiếp xúc thơng thường và là ngun nhân chính truyền nhiễm bệnh tật trong bệnh viện Các tiêu chuẩn đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của vật liệu dệt thường khuyến cáo thử nghiệm đối với 2 chủng vi khuẩn này [182-184, 186] và hầu hết các nghiên cứu cũng sử dụng 2 chủng vi khuẩn này để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn [34, 90, 110, 113, 116, 117, 134]

a Phương pháp khuếch tán đĩa thạch (AATCC 90-2011)

Các mẫu vải thử nghiệm được kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn theo tiêu chuẩn AATCC 90-2011 [183] Quy trình thực hiện được mơ tả trên Hình 2 16

Chủng kiểm định (4℃)

Nuôi trong môi trường LB lỏng

Chủng cấy ria trên đĩa thạch giữ ở 4℃

Lấy 1 khuẩn lạc nuôi trong môi trường LB lỏng 15 ml, 100 ml ở

37℃, 150 v/p, 14-16h

Trang lên đĩa thạch Trang trên đĩa mật độ 1-2

CFU/ml

108

Đặt mẫu vải lên đĩa thạch đã trang vi khuẩn

Nuôi ở 37℃, 18-24h

Xác định đường kính kháng khuẩn

Ép nhẹ mẫu vải hình trịn, đường kính 1 cm lên đĩa thạch

ZOI (mm) = D - d

Hình 2 16: Sơ đồ quy trình đánh giá khả năng kháng khuẩn của vải theo tiêu chuẩn AATCC 90-2011

Các bước thực hiện:

- Chuẩn bị các đĩa môi trường đặc: Sử dụng môi trường Brain Heart Infusion agar (BHI) với thành phần được trình bày trong Phụ lục 1

- Chuẩn bị dụng cụ: đĩa petri (đường kính 13 cm), que trang, ống fancol, ống eppendort, đầu côn, pipiet Các mẫu vải, môi trường, dụng cụ đều được thanh trùng ở 121℃, 20 phút trước khi thực hiện

- Đĩa thạch được cấy 100l vi khuẩn thử nghiệm bằng cách trang đều vi khuẩn thử nghiệm với mật độ khoảng 1 - 2108 CFU/ml lên bề mặt đĩa thạch

- Mẫu đối chứng (vải viscose không được xử lý kháng khuẩn), mẫu kiểm chứng dương được tẩm kháng sinh Cloramphenicol (10 µg) và các mẫu vải được xử lý bằng AgNPs cắt hình trịn đường kính 1 cm và được đặt trên bề mặt thạch sau khi cấy chủng vi khuẩn thử nghiệm Ấn nhẹ các mẫu vải để tiếp xúc tốt với vi khuẩn

-

Đo vùng ức chế xung quanh các mẫu vải và tính đường kính kháng khuẩn theo cơng thức 2 3

b Phương pháp kẻ vạch song song (AATCC 147-2004)

Các mẫu vải không xử lý kháng khuẩn, các mẫu vải đã xử lý và được giặt sau một số chu kỳ được kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn theo tiêu chuẩn AATCC 147- 2004 [182] Quy trình thực hiện được mơ tả trên sơ đồ Hình 2 17

Các bước thực hiện:

- Chuẩn bị các đĩa môi trường đặc: Sử dụng môi trường Nutrient Agar (NA), thành phần môi trường NA được trình bày trong Phụ lục 1

- Chuẩn bị dụng cụ: đĩa petri (đường kính 8 cm), que cấy đầu trịn, ống fancol, ống eppendort, đầu cơn, pipiet Các mẫu vải, môi trường, dụng cụ đều được thanh trùng ở 121℃, 20 phút trước khi thực hiện

- Đĩa thạch được cấy vi khuẩn thử nghiệm bằng cách sử dụng quy cấy đầu tròn 4 mm nhúng vào chủng vi khuẩn thử nghiệm và kẻ 5 vạch kẻ song song dài khoảng 60 mm trên mặt đĩa thạch, các vạch kẻ cách nhau 1 cm

Chủng kiểm định (4℃) Nuôi trong môi trường

LB lỏng

Chủng cấy ria trên đĩa thạch giữ ở 4℃ Lấy 1 khuẩn lạc nuôi

trong môi trường LB lỏng 15 ml, 100 ml ở 37℃, 150 v/p, 14-16h Cấy VK lên đĩa thạch theo

5 vạch kẻ song song

Đặt mẫu vải lên đĩa thạch đã được cấy vi khuẩn

Nuôi ở 37℃, 18-24h

Quan sát vùng ức chế

Ấn nhẹ mẫu vải lên đĩa thạch tại vị trí 5 vạch kẻ song song

Xem vùng ức chế vi khuẩn bên dưới và xung quanh mẫu vải

Hình 2 17: Sơ đồ quy trình đánh giá khả năng kháng khuẩn của vải theo tiêu chuẩn AATCC 147-2004

- Mẫu đối chứng (vải viscose không được xử lý kháng khuẩn), mẫu kiểm chứng dương được tẩm kháng sinh cloramphenicol (10 µg) và các mẫu vải được xử lý sau một số chu kỳ giặt có kích thước 15 55 mm được đặt trên bề mặt thạch được cấy chủng vi khuẩn thử nghiệm Ấn nhẹ các mẫu vải để vải tiếp xúc tốt với vi khuẩn

- -

Các mẫu được nuôi ở 37℃, 18 - 24 giờ

Hiệu quả kháng khuẩn sẽ được hiển thị bởi sự ức chế phát triển của vi khuẩn bên dưới lớp vải kháng khuẩn và vùng ức chế có thể có hai bên mép vải được xử lý kháng khuẩn

c Phương pháp định lượng (ASTM E2149-10)

Từ việc tổng quan về các phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn của vật liệu dệt, đặc tính của tác nhân kháng khuẩn và kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của vải đã xử lý theo phương pháp bán định lượng, luận án lựa chọn phương pháp lắc động để kiểm tra tính kháng khuẩn của vải Phương pháp này được thực hiện theo tiêu chuẩn ASTM E2149-10 [184] Quy trình các bước thực hiện được mơ tả trên Hình 2 18 Chủng nuôi trong môi trường lỏng (1-3 x 108 CFU/mL) Pha loãng bằng dung dịch đệm (Mẫu trắng) Vis VisFib

(1 5-3 x 105 CFU/mL) (1 5-3 x 105 CFU/mL) (1 5-3 x 105 CFU/mL)

01 phút 01 phút Pha loãng 01 phút 37℃ 24 h 25℃, 1 h 120 v/p (Mật độ ban đầu) 25℃, 1 h 120 v/p 37℃ 24 h 37℃ 24 h Đếm khuẩn lạc

Nuôi lắc Đếm khuẩn lạc Nuôi lắc

Đếm khuẩn lạc

Pha loãng Pha loãng

37℃ 24 h 37℃ 24 h

Đếm khuẩn lạc Đếm khuẩn lạc

Hình 2 18: Sơ đồ quy trình đánh giá hiệu suất kháng khuẩn của vải theo tiêu chuẩn ASTM E2149-10

* Các bước chuẩn bị:

- Chuẩn bị mẫu vải thử nghiệm: Mẫu vải được xử lý kháng khuẩn và mẫu đối chứng (không được xử lý kháng khuẩn) và các mẫu vải được xử lý sau một số chu kỳ giặt có khối lượng 1 0,1 g được cắt nhỏ (1 1 mm) để đảm bảo tiếp xúc với vi khuẩn được tốt nhất

- Chuẩn bị dung dịch đệm: Pha dung dịch đệm KH2PO4 0,3 mM (pH = 7,2 0,1) để pha loãng vi khuẩn đạt được mật độ thử nghiệm

-

Chuẩn bị dụng cụ: Bình tam giác thủy tinh 250 ml (nắp đậy, chịu nhiệt), đĩa petri (đường kính 8 cm), ống fancol, ống eppendort, đầu côn, pipet Các mẫu vải, dung dịch đệm, môi trường, dụng cụ đều được thanh trùng ở 121℃, 20 phút trước khi thực hiện

* Các bước thực hiện:

- Các chủng vi khuẩn thử nghiệm sau khi nuôi cấy đạt mật độ khoảng 1,5 - 3 108 CFU/ml được pha loãng trong dung dịch đệm KH2PO4 0,3mM để đạt mật độ thử nghiệm khoảng 1,5 - 3 105 CFU/ml

- Mẫu thử và mẫu đối chứng được cho vào bình tam giác 250 ml có nắp đậy vơ trùng riêng biệt Cho 50 0,1 ml dung dịch vi khuẩn (1,5 - 3 105 CFU/ml) vào mỗi bình thí nghiệm và một bình tam giác khơng có mẫu (chỉ có chủng)

- Đóng nắp bình và lắc 1 phút 5 giây, 120 vịng/phút Sau đó, pha lỗng, trang trên đĩa thạch để xác định mật độ tại 0 giờ tiếp xúc

- Tiếp tục lắc các bình trong khoảng thời gian 1 giờ 5 phút Tiếp theo, pha loãng, trang trên đĩa thạch để xác định mật độ tại 1 giờ tiếp xúc Mỗi độ pha loãng trang 3 đĩa lặp lại

- Tất cả các đĩa petri được nuôi ở 35 2℃, 24 giờ Đếm khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa petri và tính tỷ lệ phần trăm vi khuẩn suy giảm sau khi tiếp xúc theo công thức 2 4

� (%) = � − �

� 100% (2 4)

Trong đó: R: Hiệu suất kháng khuẩn (%); B: Số lượng vi khuẩn ban đầu (CFU/ml); A: Số lượng vi khuẩn trên mẫu đã xử lý kháng khuẩn (CFU/ml)

d Phương pháp đánh giá độ bền kháng khuẩn

Để đánh giá độ bền kháng khuẩn của vật liệu dệt, hiệu quả của chất kháng khuẩn luận án thực hiện kiểm tra khả năng kháng khuẩn sau các chu kỳ giặt Các mẫu đã xử lý kháng khuẩn được giặt đến 30 chu kỳ giặt theo tiêu chuẩn AATCC 61-2013 (2A) [191] Các mẫu vải sau một số chu kỳ giặt được kiểm tra khả năng kháng khuẩn theo tiêu chuẩn ASTM E2149-10

Điều kiện giặt: Chuẩn bị mẫu thử có kích thước 90 200 mm, vải thử kèm: Vải bông đa xơ, sử dụng bột giặt tiêu chuẩn AATCC 1993 WOB: 0,15 g/l, nhiệt độ giặt: 49℃, thời gian: 45 phút, thể tích dung dịch: 150 ml, số bi thép: 50 viên Thí nghiệm giặt được thực hiện trên thiết bị kiểm tra độ bền màu giặt tại Phịng thí nghiệm Vật liệu và Cơng nghệ Hóa dệt, Viện Dệt may - Da giầy và Thời trang, trường ĐH Bách khoa Hà Nội