14 Tổng quan về đánh giá hoạt tính kháng khuẩn
142 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của vật liệu dệt
Có rất nhiều phương pháp thử nghiệm vi sinh tiêu chuẩn để xác định hiệu quả của quá trình xử lý kháng khuẩn cho vật liệu dệt Hầu hết các phương pháp này liên quan đến việc đo lường sự phát triển của vi khuẩn trong phịng thí nghiệm bằng phương pháp định lượng hoặc bán định lượng quần thể vi sinh vật Các phương pháp thử nghiệm theo các tiêu chuẩn được tóm tắt trong Bảng 1 9 [1, 27, 28] Các phương pháp thử nghiệm để xác định hoạt tính kháng khuẩn có thể được chia thành hai loại: bán định lượng là phương pháp dựa trên vùng ức chế trên môi trường thạch; và định lượng là phương pháp đếm khuẩn lạc Cả hai loại phương pháp đều thử nghiệm đối với chủng S aureus (gram dương) và E coli hoặc K pneumoniae (gram âm) và một số chủng vi khuẩn khác tương ứng [1]
Bảng 1 9: Một số phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của hàng dệt may [1]
1 5 2 1 Phương pháp thử nghiệm bán định lượng
Phương pháp thử nghiệm bán định lượng là xác định vùng ức chế trên môi trường thạch Phương pháp này thực hiện tương đối nhanh nhưng chủ yếu phù hợp để xác định hoạt tính kháng khuẩn của tác nhân kháng khuẩn theo cơ chế giải phóng, ít dùng
Phương pháp
Thuộc tính Tiêu chuẩn
Ưu điểm Nhược điểm
Đinh lượng (đếm khuẩn lạc) - Kết quả chính xác - Phân loại sản phẩm dệt theo mục đích sử dụng - Thích hợp cho các tác nhân kháng khuẩn khuếch tán và không khuếch tán
- Tốn nhiều thời gian - Yêu cầu người kiểm
nghiệm có kỹ năng thí nghiệm tốt ASTM E2149 - 01 AATCC 100 ISO 20743 ASTM E2180 - 01 JIS L1902 Bán định lượng (dựa vào vùng ức chế trên đĩa thạch agar) - Nhanh và dễ thực hiện - Thích hợp để kiểm sốt chất lượng thường xuyên - So sánh, đánh giá hoạt tính kháng khuẩn - Kết quả định tính hoặc bán định lượng - Thích hợp chủ yếu cho các chất kháng khuẩn khuếch tán AATCC 90 AATCC 147 AATCC 174 SN 195920 ISO 20645
để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tác nhân không khuếch tán Sau đây là một số phương pháp bán định lượng thường được sử dụng
a Tiêu chuẩn AATCC 147
Nguyên lý đánh giá [182]:
Đĩa thạch được cấy vi khuẩn thử nghiệm bằng cách sử dụng quy cấy đầu tròn nhúng vào chủng vi khuẩn thử nghiệm và kẻ 5 vạch kẻ song song trên mặt đĩa thạch Các mẫu vải thử được đặt trên bề mặt thạch được cấy chủng vi khuẩn thử nghiệm và nuôi ở 37℃, 18 - 24 giờ Hiệu quả kháng khuẩn sẽ được hiển thị bởi sự ức chế phát triển của vi khuẩn bên dưới lớp vải kháng khuẩn và vùng ức chế (vùng thạch trong) có thể có xung quanh mẫu vải được xử lý kháng khuẩn so với mẫu đối chứng Hình 1 42 minh họa phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn theo tiêu chuẩn AATCC 147
Hình 1 42: Minh họa phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn theo tiêu chuẩn AATCC 147
Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn theo tiêu chuẩn AATCC 147 có ưu điểm dễ thực hiện nhanh, có thể thử nghiệm đối với các chủng gram dương, gram âm, là công cụ để thử nghiệm sàng lọc trước khi sử dụng tiêu chuẩn đánh giá định lượng (AATCC 100, ASTM E2149) Tuy nhiên, phương pháp này có một số nhược điểm như kết quả định tính, khơng phù hợp để thử nghiệm các chất kháng khuẩn khơng khuếch tán, khó khăn khi so sánh khả năng kháng khuẩn của các mẫu thử nghiệm
b Tiêu chuẩn AATCC 90-2011
Nguyên lý đánh giá [183]
Đĩa thạch được cấy vi khuẩn thử nghiệm bằng cách trang đều vi khuẩn thử nghiệm lên bề mặt đĩa thạch Các mẫu vải thử được cắt hình trịn và được đặt trên bề mặt thạch sau khi cấy chủng vi khuẩn thử nghiệm và nuôi ở 37℃, 18 - 24 giờ Hiệu quả kháng khuẩn sẽ được đánh giá thơng qua xác định kích thước vùng ức chế phát triển của vi khuẩn xung quanh mẫu vải
Tính chiều rộng vùng ức chế theo cơng thức 1 2:
W = (T - D)/2 (1 2)
Trong đó:
+ T: Đường kính kháng khuẩn, mm + D: Đường kính mẫu, mm
Khi đường kính kháng khuẩn càng rộng thì hiệu quả kháng khuẩn càng cao Trình tự thực hiện gồm các bước được mơ tả trên Hình 1 43 [1]
Hình 1 43: Các bước thử nghiệm kháng khuẩn theo phương pháp bán định lượng (a) chuẩn bị chủng vi khuẩn thử nghiệm, (b) cấy vi khuẩn lên môi trường, (c) đặt
mẫu vải thử nghiệm lên đĩa thạch, (d) vùng ức chế vi khuẩn trên đĩa thạch
Ngồi 2 tiêu chuẩn này cịn có có một số tiêu chuẩn bán định lượng khác như tiêu chuẩn EN ISO 20645, SN 195920… xác định khả năng kháng khuẩn của vật liệu dệt [1]
1 5 2 2 Phương pháp thử nghiệm định lượng
Nguyên lý chung của phương pháp định lượng [28]:
Cho mẫu đã xử lý kháng khuẩn tiếp xúc với một số lượng vi khuẩn theo quy định (A0) Xác định lượng vi khuẩn có trên vải sau thời gian tiếp xúc t, giả sử là At Cho mẫu đối chứng (không xử lý kháng khuẩn) tiếp xúc với cùng số lượng vi khuẩn A0 Giả sử sau thời gian tiếp xúc t thì số lượng vi khuẩn trên mẫu kiểm chứng là Bt So sánh mối tương quan giữa A0, At, Bt để đánh giá khả năng kháng khuẩn của mẫu:
+ Nếu At < A0: Vải diệt khuẩn, tỷ lệ diệt khuẩn được tính theo cơng thức 1 3
� = [(�0 − �� )/�0] 100%∗
+ Nếu A0 < At < Bt: Vải kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn
(1 3) Phương pháp định lượng thường được thử nghiệm theo hai nguyên lý: nguyên
lý lắc động và nguyên lý tiếp xúc bề mặt [28]
Để đánh giá định lượng về hiệu quả kháng khuẩn, các phương pháp thử nghiệm thực hiện bằng cách đếm khuẩn lạc Trong trường hợp này, số lượng vi khuẩn được đưa vào các mẫu vải thử nghiệm và mẫu đối chứng tại các thời điểm khác nhau 0 giờ, 18 - 24 giờ nuôi cấy hoặc các mốc thời gian khác Sau đó, đếm vi khuẩn bằng phương pháp định lượng ATP hoặc bằng cách đếm trực quan các khuẩn lạc trên đĩa thạch nuôi cấy (CFU) Dựa trên số lượng của ATP hoặc số lượng CFU được xác định tại các mốc thời gian tiếp xúc và nuôi 18 - 24 giờ để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Sau đây là một số phương pháp định lượng thường hay được sử dụng
a Tiêu chuẩn ASTM E2149
* Nguyên lý thử nghiệm [184]:
Tiêu chuẩn này được thực hiện theo nguyên lý lắc động để đảm bảo mẫu thử được tiếp xúc tốt với dung dịch vi khuẩn trong suốt quá trình thử [184] Quy trình đánh giá hoạt tính kháng khuẩn theo tiêu chuẩn ASTM E2149 được minh họa trên Hình 1 44
* Quy trình thử nghiệm:
Vi khuẩn E coli sau khi hoạt hóa trong mơi trường Tryptic Soy Broth đạt mật độ 1,5 - 3 108 CFU/ml được pha lỗng với dung dịch đệm vơ trùng đạt nồng độ thử nghiệm là 1,5 - 3 105 CFU/ml Các mẫu thử được cắt nhỏ để đảm bảo tiếp xúc tốt với vi khuẩn và được lắc với tốc độ cao Sau các khoảng thời gian tiếp xúc thì thực
hiện các chuỗi pha loãng và trang lên đĩa thạch Các đĩa petri được nuôi ở 35 2℃, 24 giờ Đếm khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa petri và tính tỷ lệ phần trăm vi khuẩn suy giảm sau các khoảng thời gian tiếp xúc theo cơng thức 1 3
Hình 1 44: Mơ phỏng quy trình đánh giá hoạt tính kháng khuẩn theo tiêu chuẩn ASTM E2149 [185]
5
nhỏ; (3) cho mẫu thử vào bình 250 ml chứa 50 ml chủng; (4) Lắc; (5) Hút 1 ml dung dịch theo các khoảng thời gian tiếp xúc khác nhau; (6) pha loãng và (7) trang
lên đĩa thạch, ni và tính tốn tỷ lệ giảm so với đối chứng
Phương pháp này có các ưu điểm như đảm bảo được sự tiếp xúc của mẫu thử với dung dịch vi khuẩn trong suốt quá trình thử, cho phép đánh giá chính xác khả năng kháng khuẩn của mẫu thử với các chủng vi khuẩn thử nghiệm Tuy nhiên, phương pháp đánh giá này tốn nhiều hóa chất, địi hỏi nhiều thời gian và kỹ năng của người làm thí nghiệm
b Tiêu chuẩn AATCC 100
* Nguyên lý thử nghiệm [186]:
Tiêu chuẩn này được thực hiện theo nguyên lý tiếp xúc bề mặt Mẫu vải được nuôi cấy chủng khuẩn thử nghiệm, sau khi nuôi cấy vi khuẩn được phân lập ra khỏi vải bằng cách lắc trong dung dịch trung hòa Số vi khuẩn trong dung dịch sẽ được xác định bằng phương pháp pha loãng, trang lên đĩa thạch để nuôi và đếm khuẩn lạc Đánh giá kết quả thông qua tỷ lệ vi khuẩn giảm của mẫu được xử lý kháng khuẩn so với mẫu không xử lý theo các mốc thời gian
* Các bước chuẩn bị:
- Chuẩn bị mẫu vải thử nghiệm: Mẫu vải thử được cắt dạng hình trịn, đường kính 4,8 0,1 cm Số lượng mẫu đủ để thấm hút hết 1 ml dung dịch vi khuẩn
- Chuẩn bị dung dịch đệm: dung dịch đệm muối phốt phát (NaCl 8 g/l; KCl 0,2 g/l; Na2HPO4 1,15 g/l, KH2PO4 0,2 g/l)
- -
Môi trường: Trypticase Soy hoặc Brain Heart Infusion Broth
Chuẩn bị dụng cụ: Bình thủy tinh 250 ml có nắp đậy (miệng rộng), đĩa petri (đường kính 8 cm), ống fancol, ống eppendort, đầu côn, pipiet Các mẫu vải, dung dịch đệm, môi trường, dụng cụ đều được thanh trùng trước khi thực hiện
* Chủng vi khuẩn thử nghiệm [186]:
- S aureus, K pneumoniae với mật độ khoảng 1 - 2 105 CFU/ml
* Quy trình thực hiện: Các bước thực hiện được minh họa trên Hình 1 45 [185]
Hình 1 45: Mơ phỏng các bước thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn theo tiêu chuẩn AATCC 100 [185]
5
chủng vi khuẩn vào các mẫu vải; (4) chuyển các mẫu vải từ đĩa sang bình đậy nắp; (5) ni các mẫu (lặp lại 3 lần); (6) thêm dung dịch trung hịa; (7) pha lỗng và cấy
lên đĩa thạch
Phương pháp thử nghiệm theo tiêu chuẩn AATCC 100 có những ưu điểm định lượng được khả năng kháng khuẩn và kết quả lặp lại dễ dàng Tuy nhiên, phương pháp này có một số nhược điểm là tốn nhiều thời gian để thực hiện, không phù hợp với mẫu tử khơng hấp thụ nước, địi hỏi kỹ năng làm thí nghiệm tốt
Ngồi hai phương pháp đã trình bày ở trên cịn có các phương pháp định lượng khác để đánh giá khả năng kháng khuẩn của vật liệu dệt như tiêu chuẩn EN ISO 20743, JIS L 1902
Tóm lại, phương pháp bán định lượng được thực hiện dễ dàng, nhanh chóng nhưng chỉ đánh giá so sánh hoạt tính kháng khuẩn giữa mẫu xử lý kháng khuẩn và mẫu đối chứng (không được xử lý) Ngược lại, các phương pháp định lượng cho thấy kết quả hoạt tính kháng khuẩn của hàng dệt được xử lý chính xác, do đó cho phép phân loại chúng theo các nhóm sản phẩm phù hợp như sản phẩm vệ sinh hoặc những sản phẩm phù hợp để sử dụng trong các lĩnh vực khác nhau Tuy nhiên, phương pháp đánh giá định lượng có hai nhược điểm chính: (i) tốn nhiều thời gian, tốn nhiều hóa chất và (ii) địi hỏi người thực hiện địi hỏi phải có kỹ năng tốt thì kết quả mới đáng tin cậy Vì vậy, để lựa chọn phương pháp thử nghiệm phù hợp cần căn cứ vào cơ chế hoạt động của chất kháng vi sinh vật và loại vi sinh vật được thử nghiệm và mục đích thử nghiệm