- Đưa cây invitro ra điều kiện bên ngoài: Để tìm giá thể thích hợp cho cây con
kết quả nghiên cứu và thảo luận
3.1. ảnh hưởng của thời gian lấy mẫu trong năm, loại vật liệu và tuổi vật liệu
nhân giống đến khả năng tái sinh chồi thông in vitro
Thơng caribê là lồi cây sinh trưởng nhanh, thích hợp với điều kiện khí hậu và lập địa ở nước ta, ở miền Bắc, cây sinh trưởng tốt ở hầu hết các mùa trừ mùa đông do điều kiện thời tiết khô và lạnh. Theo nghiên cứu của Wareing (1964) cho biết rừng Thông caribê ở Bắc Nigieria sinh trưởng nhanh vào giữa tháng Tư đến tháng Mười hai vào mùa mưa, sinh trưởng giảm 70-80% vào mùa khô [28]. Một nghiên cứu khác được thực hiện tại Afaka gần Kaduna, cho thấy sinh trưởng chiều cao thông caribaea đạt trung bình 3 cm giai đoạn từ tháng Năm đến tháng Mười hai (mùa mưa) và chỉ đạt trung bình 1 cm trong thời gian từ tháng Một đến tháng Năm (mùa khô)[28].
3.1.1. ảnh hưởng của thời gian lấy mẫu trong năm đến tỷ lệ sống của mẫu cấy
Để tìm hiểu ảnh hưởng của nhân tố mùa vụ cũng như trạng thái sinh trưởng dẫn đến các biến đổi sinh lý trong mơ, cơ quan có liên quan đến khả năng tái sinh chồi và sự nhiễm nấm bệnh trong ni cấy in vitro lồi Thông caribê, chúng tôi tiến hành lấy mẫu cấy vào 4 thời gian khác nhau (theo các cơng thức thí nghiệm 1). Thí nghiệm được tiến hành nhằm xác định được thời gian thích hợp cho việc đưa mẫu cấy vào môi trường vô trùng thành công nhất. Mẫu cấy dùng trong thí nghiệm là đoạn chồi non (1,5 – 2.0 cm) của cây hom 4 năm tuổi (đoạn ngọn). Mẫu cấy được khử trùng theo phương pháp khử trùng bằng hoá chất (khử trùng bằng H2O2 5% trong 20 phút), sau đó mẫu được ni cấy trên mơi trường WPM có 2 % đường sacarose, 4,5 % agar, bổ sung 1 mg/l BAP. Qua theo dõi trong thời gian từ 2 – 5 tuần, thấy số mẫu sạch và hình thành chồi, số mẫu nhiễm nấm khuẩn và số mẫu
khơng nhiễm nhưng khơng hình thành chồi ở các thời điểm có sự khác nhau. Kết qủa thí nghiệm được trình bày trong bảng 3.1, hình 3.1 và được phân tích thống kê (chi tiết trong phụ lục 2).
Bảng 3.1: Tỷ lệ sống của mẫu cấy ở các thời gian lấy mẫu khác nhau.
Đợt Tổngsố Số mẫu sống Số mẫu nhiễm và chết
thí mẫu và sạch Mẫu nhiễm Mẫu chết Tổng Tỷ lệ
nghiệm cấy Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ số (%)
mẫu (%) mẫu (%) mẫu (%)
I 90 29 32.22 41 45.56 20 22.22 61 67.78 (8/2005) II 90 9 10.00 23 25.56 58 64.44 81 90.00 (11/2005) III 90 5 5.56 24 26.67 61 67.78 85 94.44 (2/2006) IV 90 23 25.56 43 47.78 24 26.67 67 74.44 (5/2006) 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 T ỷ l ệ m ẫ u (% ) I II III IV Thờiđiểm lấy mẫu
Hỡnh 3.1: Biểu đồ tỷ lệ sống của mẫu cấy tại cỏc thời gian khỏc nhau trong năm Mẫu sạch, cú khả năng hỡnh thành chồi Mẫu nhiễm nấm khuẩn Mẫu chết
Kết quả theo dõi q trình thí nghiệm và qua phân tích thống kê cho thấy có sự sai khác về tình trạng mẫu cấy sau 5 tuần nuôi cấy ở các thời gian lấy mẫu khác nhau trong năm: số mẫu sống, sạch có khả năng hình thành chồi ở thời điểm tháng Tám là cao nhất (32,22%); số mẫu nhiễm nấm, vi sinh vật khác ở thời điểm tháng Năm là cao nhất (47,78%); số mẫu chết, khơng có khả năng hình thành chồi ở thời điểm tháng Hai là cao nhất (67,78%). Bảng kiểm định χ2 cho kết quả Pearson χ2 =75,265 với mức nghĩa (sác xuất) p = 0,000<0,05, tức là ở các thời điểm lấy mẫu cấy khác nhau đã cho tỷ lệ mẫu cấy đạt yêu cầu khác nhau. Như vậy tỷ lệ mẫu sạch, có khả năng hình thành chồi của thơng phụ thuộc vào thời điểm lấy mẫu.
Điều này có thể được giải thích rằng, do điều kiện khí hậu Việt Nam biến đổi mang tính chất chu kỳ theo mùa trong năm đã dẫn đến sự biến đổi về sinh lý, sinh hố theo mùa trong q trình sinh trưởng và phát triển của thực vật nhằm thích hợp với điều kiện khí hậu. Do vậy, sinh trưởng và phát triển của thực vật nói chung và cây thơng nói riêng có sự khác nhau trong các mùa khác nhau, dẫn đến trạng thái sinh lý và sinh hoá của chồi cây khác nhau tại mỗi thời điểm trong sự thay đổi điều kiện của mơi trường bên ngồi. Điều này đã ảnh hưởng đến kết quả của thí nghiệm.
Khí hậu trong khoảng thời gian lấy mẫu cấy là yếu tố tổng hợp của các điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng … Những yếu tố này đã ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của cây. Những sai khác rõ rệt trong bốn thời điểm lấy mẫu cấy ở đây là do các yếu tố trên. Đợt lấy mẫu cấy vào tháng Năm và tháng Tám, cây đang trong mùa sinh trưởng có trao đổi chất mạnh mẽ, hormone nội sinh điều hồ nên có thể cho tỷ lệ mẫu sống có khả năng nảy chồi lớn. Tuy nhiên do ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh, mẫu cấy lấy vào hai thời điểm này khi đưa vào ống nghiệm có tỷ lệ mẫu nhiễm nấm, vi khuẩn và các vi sinh vật khác cao (≈45 – 48%). Theo chúng tơi có thể là do thời gian này là mùa mưa, độ ẩm khơng khí cao tạo điều kiện thuận lợi cho nấm, vi khuẩn … phát triển. Đợt lấy mẫu vào tháng Mười một và tháng Hai có thể nhiệt độ khơng khí thấp, sâu bệnh ít nên mẫu dễ khử
trùng, tỷ lệ nhiễm thấp. Như vậy thời điểm lấy mẫu cấy ảnh hưởng lớn tới khả năng tái sinh chồi ban đầu, sự nhiễm nấm bệnh của mẫu cấy Thơng caribê.
Từ hình 3.1 cho thấy thời gian trong năm thích hợp cho việc đưa mẫu cấy vào ống nghiệm là tháng Tám.
Kết quả thí nghiệm của chúng tơi phù hợp với công bố của Anja Hohtoia (1988) khi nghiên cứu về khả năng sống và sự nhiễm nấm bệnh của mẫu cấy trong nuôi cấy mô cây thông Scots (Pinus sylvestris L.) ở phía Bắc Phần Lan [24].
Nghiên cứu cho thấy rằng khả năng sống và mức độ nhiễm nấm bệng của mẫu vật nuôi cấy bị ảnh hưởng theo mùa, mẫu cấy phát triển tốt vào mùa sinh trưởng từ tháng Tư đến tháng Mười hai, phát triển kém vào mùa Đông.
3.1.2. ảnh hưởng của loại vật liệu nhân giống và tuổi vật liệu nhân giống đến
sự tái sinh chồi thông in vitro
Khả năng tái sinh chồi trong ống nghiệm là dấu hiệu đầu tiên cho biết mẫu vật có thể có khả năng nhân giống, các chồi hình thành trong giai đoạn này sẽ là nguồn nguyên liệu cho các giai đoạn nhân giống tiếp theo. Khả năng tái sinh chồi phụ thuộc vào một số yếu tố như loại vật liệu nhân giống, giai đoạn tuổi …
Các đoạn chồi được ni cấy trong mơi trường WPM có bổ sung 2 % đường sacaroza, 4,5 % agar, 1 mg/l BAP theo các cơng thức thí nghiệm 2. Số liệu thu thập ở phụ lục 3, được phân tích thống kê (phụ lục kèm theo) và được trình bày tại bảng 3.2, hình 3.2.
Bảng 3.2:ảnh hưởng của vật liệu và tuổi vật liệu nhân giống
đến sự hình thành chồi thơng in vitro(sau 8 tuần nuôi cấy)