- Đưa cây invitro ra điều kiện bên ngoài: Để tìm giá thể thích hợp cho cây con
A- Chồi đỉnh của cây mầm vô trùng B Đoạn chồi non của cây hạt 2 năm tuổi.
3.3.1. ảnh hưởng của các chất điều hồ sinh trưởng nhóm cytokinin đến hệ số
nhân chồi và sinh trưởng của chồi
Thí nghiệm thực hiện để xác định ảnh hưởng độc lập của nhóm cytokinin đến sự phát sinh chồi và sinh trưởng của chồi thông, làm cơ sở cho việc lựa chọn và bổ sung tổng hợp nhóm chất chất điều hồ sinh trưởng auxin.
Cytokinin là một nhóm chất chất điều hồ sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào, các cytokinin thường gặp là Kinetin và 6-benzyl aminopurin (BAP). BAP và Kinetin cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự già hố của tế bào. Ngồi ra các chất này có tác dụng lên q trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp AND, tổng hợp protein…19.
Kinetin thực chất là một dẫn xuất của bazơ nitơ adenine, được Skoog phát hiện ngẫu nhiên trong khi chiết xuất axit nucleic thường được dùng trong nuôi cấy mô nhiều loại cây trồng. BAP là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn Kinetin. Trong ni cấy mơ tế bào thực vật, BAP có tác dụng kích thích tạo chồi mạnh, được sử dụng rộng rãi trong các môi trường nhân nhanh chồi. Trong một số trường hợp BAP là chất không thể thay thế được trong q trình ni cấy.
Chồi được cấy vào môi trường SH mod. bổ sung Kinetin hoặc BAP ở các nồng độ theo các cơng thức thí nghiệm 4.1. Theo dõi số chồi được hình thành, sự tăng trưởng về chiều cao của chồi con. Số liệu thu thập ở phụ lục 5, được tổng hợp tại bảng 3.4 và trình bày trên hình 3.4.
Bảng 3.4:ảnh hưởng của Kinetin và BAP lên sự hình thành
Chất ĐHST Cơng thức Nồng độ (mg/l) Hệ số nhânchồi (lần) Chiều cao trung bình chồi (cm) K1 0,1 1,490,06 2,480,08 Kinetin K2 0,9 2,500,05 1,440,04 K3 1,7 4,400,09 0,310,01 K4 2,5 5,880,27 0,300,00 B1 0,1 1,870,05 3,300,05 BAP B2 0,9 3,000,18 1,400,11 B3 1,7 4,030,09 0,490,03 B4 2,5 5,970,10 0,300,02 1.49 2.48 2.50 1.44 4.40 0.31 5.88 0.30 1.87 3.30 3.00 1.40 4.03 0.49 5.97 0.30 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 G iá tr ị t ru ng b ìn h K1 K2 K3 K4 B1 B2 B3 B4 Cụng thức thớ nghiệm
Hỡnh 3.4: Biểu đồ ảnh hưởng của Kinetin và BAP lờn sự hỡnh thành và sinh trưởng của chồi thụng in vitro
Hệ số nhõn chồi
Chieu cao TB cua choi
Trong môi trường nuôi cấy, sau 4 tuần nuôi cấy, các cụm chồi được hình thành gồm hỗn hợp các loại chồi phát triển ở các mức độ khác nhau. Tuỳ theo mức độ phát triển của các chồi, chúng tôi phân biệt thành chồi trội, chồi hữu hiệu và chồi không hữu hiệu. Các chồi trội là những chồi phát triển nhất, mang nhiều lá và cao hơn các chồi khác trong cụm chồi, chiều cao từ 2,0 cm trở lên. Chồi hữu hiệu là những chồi có đỉnh sinh trưởng rõ ràng, các lá quanh đỉnh sinh trưởng tương đối phát triển nhưng chiều cao chỉ đạt 1,0 – 2, 0 cm. Các chồi khơng hữu hiệu có dạng mầm chồi, khơng có lá hoặc lá rất ngắn, mập. Trong tất cả các môi trường ni cấy
ngồi hệ số nhân chồi, chiều cao trung bình của chồi thể hiện tỷ lệ chồi hữu hiệu và độ vươn chồi là một chỉ tiêu đánh giá hiệu quả của mơi trường.
Kết quả phân tích phương sai cho thấy với mức ý nghĩa α = 0,05, đối với hệ số nhân chồi, nhân tố chất điều hồ sinh trưởng có giá trị F tính được 1,764 và mức ý nghĩa p = 0,200 > 0,05, điều đó nói lên rằng sự sai khác là khơng có ý nghĩa, tức là 2 loại chất cytokinin đã ảnh hưởng đồng đều đến hệ số nhân chồi thơng in vitro; nhân tố nồng độ có giá trị F tính được 257,703 với mức ý nghĩa p = 0,000 < 0,05, điều đó nói lên rằng sự sai khác là có ý nghĩa, tức là nồng độ cytokinin khác nhau trong các cơng thức thí nghiệm đã có ảnh hưởng không đồng đều đến hệ số nhân chồi thông in vitro.
Tương tự như hệ số nhân chồi, từ kết quả phân tích thống kê (chi tiết trong bảng phụ lục 5) thấy sinh trưởng chiều cao trung bình của chồi thơng in vitro ở các nồng độ khác nhau không đồng nhất. Như vậy với cùng một đối tượng nuôi cấy, các cytokinin khác nhau (Kinetin và BAP) cho kết quả nuôi cấy không khác nhau. Thay đổi nồng độ 2 chất trên từ 0,1 – 2,5 mg/l đã có ảnh hưởng rõ rệt đến hệ số nhân, sinh trưởng của chồi thơng trong ống nghiệm. Từ hình 3.4 cho thấy khi tăng dần nồng độ của Kinetin và BAP lên từ 0,1 mg/l – 2,5 mg/l (công thức K1 – K4; B1 – B4) hệ số nhân chồi tăng tương ứng từ 1,49; 1,87 lần đến 5,88; 6,97 lần sau 8 tuần nuôi cấy.
Trong mơi trường có hàm lượng cytokinin cao nhất (2,5 mg/l), tốc độ phát sinh chồi rất nhanh, nhiều chồi li ti được hình thành và thực tế khó đo đếm được chính xác số chồi khơng hữu hiệu. Hệ số nhân chồi của các công thức này đạt trên 5,0 lần nhưng phần lớn các chồi ở dạng mầm chồi (không phải chồi hữu hiệu), lá rất ngắn và phát triển yếu, do đó sau thí nghiệm này chúng tơi khơng tiếp tục tăng hàm lượng cytokinin (BAP và Kinetin) lên nữa.
Cytokinin cũng tỏ ra có ảnh hưởng rõ rệt đến sự sinh trưởng của các chồi, hàm lượng cytokinin càng cao, sinh trưởng chiều cao của chồi càng giảm và số chồi hình thành thuộc dạng không hữu hiệu tăng lên. ở nồng độ 0,1 mg/l, sinh
trưởng chiều cao trung bình của chồi là 2,48 – 3,30 cm. Khi tăng nồng độ lên 0,9 mg/l chiều cao trung bình của chồi giảm xuống đến 1,4 cm và trong mơi trường có 1,7 mg/l; 2,5 mg/l chiều cao trung bình của chồi chỉ đạt 0,3 cm. Như vậy, ở nồng độ cao cytokinin có tác dụng kìm hãm sự sinh trưởng của các chồi. Khi tăng nồng độ cytokinin trong mơi trường thì hệ số nhân chồi thông in vitro cũng tăng lên nhưng sinh trưởng chiều cao của chồi lại giảm đi.
Hiện tượng hệ số nhân chồi càng tăng nhưng sinh trưởng chiều cao của chồi càng giảm có tính chất quy luật ở các cơng thức môi trường và phụ thuộc vào việc tăng hàm lượng cytokinin. Như vậy, trong nuôi cấy chồi thông in vitro, các cytokinin khác nhau có tác động như nhau lên sự hình thành và sinh trưởng của các chồi, nhưng các nồng độ khác nhau của cytokinin có ảnh hưởng đến khả năng tạo chồi non của mô nuôi cấy.
Các kết quả nghiên cứu của chúng tơi trong thí nghiệm này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Dilip Nandwani, Suman Kumari và các cộng sự (2001) khi nghiên cứu vi nhân giống thông Khasi (Pinus kesiya). Họ đã thấy Kinetin và BAP có ảnh hưởng ngang nhau trong q trình tái sinh chồi thơng Khasi. Các tác động của cytokinin trong mơi trường đến q trình ni cấy có chiều hướng tương tự các quan sát đã được thông báo trong nuôi cấy Pinus elliottii (Burns và các cộng sự - 1991), Pinus heldreichii(Stojicic và các cộng sự – 1999) [35].
Trong công thức mơi trường có 0,9 mg/l BAP, hệ số nhân đạt 3,0 lần, các chồi sinh trưởng tốt hơn so với các cơng thức mơi trường đã thử nghiệm. Vì vậy ở các thí nghiệm tiếp theo, chúng tơi sử dụng hợp chất BAP và thay đổi hàm lượng xung quanh nồng độ 0,9 mg/l nhằm thu được hệ số nhân chồi và sinh trưởng chồi tốt hơn.