- Đưa cây invitro ra điều kiện bên ngoài: Để tìm giá thể thích hợp cho cây con
A- Chồi đỉnh của cây mầm vô trùng B Đoạn chồi non của cây hạt 2 năm tuổi.
3.2. ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tái sinh và sinh trưởng của
chồi trong giai đoạn kích thích tạo chồi
Trong nhân giống in vitro, môi trường nuôi cấy là nguồn cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho cây trong cả quá trình. Do các mẫu vật khi bị tách rời khỏi cây mẹ không cịn khả năng tự dưỡng, nếu khơng tiếp tục cung cấp chất dinh dưỡng thì chúng sẽ chết. Để tồn tại, phân hoá và tiếp tục phát triển trong điều kiện in vitro, chúng cần được cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sống của mô.
Khả năng tái sinh và phát triển của chồi trong quá trình nuôi cấy in vitro là nhân tố quan trọng quyết định sự thành bại và tốc độ của việc ứng dụng quy trình nhân giống in vitro cho một đối tượng, tuy nhiên khả năng này không những phụ thuộc vào từng lồi, từng dịng và giai đoạn tuổi của từng đối tượng cụ thể mà cịn phụ thuộc vào mơi trường ni cấy.
Hệ số nhân chồi của của thơng trong q trình ni cấy in vitro phụ thuộc nhiều vào môi trường ni cấy, hàm lượng khống, các chất điều hoà sinh trưởng…Các nghiên cứu giai đoạn này nhằm tìm ra được mơi trường thích hợp nhất cho q trình nhân chồi. Đây là giai đoạn quyết định hiệu quả của kỹ thuật nhân giống. Giai đoạn này, các thử nghiệm được tiến hành để xác định được ảnh hưởng của mơi trường dinh dưỡng khống, tác dụng của chất điều hồ sinh trưởng lên q trình nhân chồi thơng in vitro.
Khi bắt đầu nuôi cấy mô tế bào cho một đối tượng, vấn đề đầu tiên cần đặt ra là chọn mơi trường có hàm lượng khống nào, trên cơ sở nào để phối hợp tỷ lệ các chất tạo nên mơi trường đó. Việc tìm mơi trường thích hợp cho sự tồn tại, phân hố và phát triển của mô nuôi cấy là vấn đề quan trọng, quyết định sự thành bại của q trình ni cấy.
Đã có rất nhiều mơi trường khác nhau được thiết lập như MS, White, WPM, B5…là những môi trường được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy in vitro thực vật. Việc xây dựng các môi trường nuôi cấy cho một đối tượng được dựa trên các cơ sở xem xét các nhu cầu về dinh dưỡng cho từng nhóm lồi cây nhất định.
Tuy nhiên việc lựa chọn được mơi trường thích hợp cho Thơng caribê là vấn đề khó. Tìm hiểu ảnh hưởng của mơi trường khoáng lên khả năng tái sinh chồi in vitro từ mẫu nuôi cấy, qua tham khảo một số tài liệu, báo cáo đã công bố, chúng tôi đã chọn 7 môi trường cơ bản và 2 môi trường cải tiến cho nuôi cấy thông là: SH (1972); WPM (1981); GD (1972); MCM (1983); LPm (1981); Cheng (1978); AE (1975); GD mod (1981); SH mod (1981). Thành phần và hàm lượng các chất dinh dưỡng ở các môi trường này khác nhau (phụ lục 1), trên cơ sở 9 loại môi trường
tượng nghiên cứu là Thông caribê. Chồi được cấy vào mơi trường các mơi trường thí nghiệm (theo các cơng thức thí nghiệm 3). Theo dõi số chồi được hình thành, sự sinh trưởng về chiều cao của chồi con, số liệu thu thập ở phụ lục 4, được phân tích thống kê trình bày tại bảng 3.3, hình 3.3.
Bảng 3.3:ảnh hưởng của mơi trường khống lên sự hình thành
và sinh trưởng chồi từ mẫu ni cấy (sau 8 tuần nuôi cấy).
Tên môi trường Công thức Hệ số nhân chồi (lần)
Chiều cao trung bình chồi (cm) WPM 1 1,500,10 1,840,02 SH 2 1,680,04 2,250,03 LPm 3 1,330,13 2,590,09 MCM 4 0,950,03 2,360,05 AE 5 0,740,05 2120,04 Cheng 6 0,790,02 2,110,07 GD 7 1,060,03 2,290,06 GD mod. 8 1,080,05 2,310,05 SH mod. 9 1,880,03 2,440,07
1.84 2.25 2.25 2.59 2.36 2.12 2.11 2.29 2.31 2.44 1.50 1.68 1.33 0.95 0.74 0.79 1.06 1.08 1.88 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 G iỏ t r ị t ru n g b ỡn h WPM SH LPm MCM AE Cheng GD GD mod. SH mod.
Mụi trường k hoỏng
Hỡnh 3.3: Biểu đồ ảnh hưởng của hàm lượng khoỏng lờn sự hỡnh thành và sinh trưởng của chồi thụng in vitro
Hệ số nhõn chồi (lần)
Chiều cao TB của chồi (cm)
Kết quả thí nghiệm cho thấy rằng, trên mơi trường khống SH; SH mod. chồi được hình thành nhiều hơn các môi trường khác (tương ứng 1,68 và1,88 lần) và sinh trưởng tốt hơn (cao trung bình 2,25 và 2,44 cm). Mơi trường LPm có sinh trưởng của chồi là 2,59 nhưng hệ số nhân chồi trung bình đạt thấp hơn (1,33 lần), chồi mướt, có biểu hiện mọng nước, lá có màu xanh đậm. Cơng thức mơi trường AE, Cheng, MCM có hệ số nhân chồi thấp hơn cả (tương ứng là 0,74 lần; 0,79 và 0,95 lần), một số chồi cấy ban đầu có biểu hiện chết 3 tuần ni cấy, số chồi cịn lại mặc dù có vươn lên nhưng qua quan sát hình thái bên ngồi thấy chồi cịi cọc, vàng vọt. Hiệu quả hình thành chồi trên các mơi trường WPM; GD; GD mod. còn thấp, sinh trưởng của các chồi chậm.
Kết quả phân tích phương sai cho thấy với mức ý nghĩa α = 0,05, các giá trị thống kê F tính tốn của hệ số nhân chồi và sinh trưởng chiều cao đều có mức ý nghĩa p-value < 0,05 (chi tiết trong phụ lục 4) nói lên các cơng thức thí nghiệm đã ảnh hưởng tới sự hình thành chồi và sinh trưởng chiều cao. Như vậy chứng tỏ việc sử dụng các mơi trường có hàm lượng khống khác nhau đã có ảnh hưởng rất khác nhau đến khả năng nhân chồi và sinh trưởng của chồi thông trong ống nghiệm.
Thành phần mơi trường được sử dụng trong thí nghiệm (phụ lục 1) với dung dịch đa lượng của một vài công thức được dựa trên hàm lượng của Gambor (1966) và SH (1972). Hàm lượng ion của hầu hết các mơi trường trong thí nghiệm ít hơn mơi trường MS (1963) và khơng có một mơi trường nào chứa nồng độ cao của ion ammonium hoặc khơng có ammonium nitrat.
Từ kết quả của thí nghiệm, chúng tơi giải thích rằng sự thay đổi hàm lượng khống chủ yếu là các chất đa lượng và vi lượng như Nitơ, Phốt pho, Kali, Mangan…đã ảnh hưởng đến quá trình hình thành và phát triển của chồi thông in vitro.
Trong các môi trường đã được thử nghiệm, môi trường SH và SH mod. cho hệ số nhân chồi và sinh trưởng của chồi tốt nhất (hình 3.3). Trong hai mơi trường SH và SH mod., môi trường SH mod. cho hệ số nhân và sinh trưởng chồi tốt hơn có thể do mơi trường này có hàm lượng MnSO4.7H2O và một số chất chứa Đồng, Molipđen, Coban cao hơn (phụ lục 1), chứng tỏ các chất vi lượng có một vai trị sinh lý quan trọng trong sinh trưởng, phát triển của chồi tương tự như ở cây trồng ngoài đất.
Trên cơ sở kết quả thu được từ thí nghiệm nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên sự hình thành và sinh trưởng của chồi thơng in vitro, môi trường SH mod. cho hệ số nhân chồi cao hơn các mơi trường khác (1,88 lần) và có sinh trưởng chồi tốt hơn (cao trung bình 2,44 cm) sẽ được dùng tiếp trong các thí nghiệm sau.
Kết quả nghiên cứu này của chúng tôi thống nhất với kết quả nghiên cứu của tác giả như Trần Trung Hiếu và các cộng sự [6]. Các tác giả này khi nuôi cấy mô đỉnh sinh trưởng Thông caribê trên các môi trường khác nhau đã thu được hệ số nhân chồi cao và sinh trưởng của chồi tốt nhất trên môi trường SH.