CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4.1. Kiểm tra đại thể, vi thể và xác định khả năng sinh enzyme amylase và
protease ngoại bào
4.1.1. Kiểm tra đại thể và vi thể
Trên môi trường thạch đĩa 802, khuẩn lạc Bacillus amyloliquefaciens NBRC 14141 có màu trắng sữa, trịn, rìa dợn sóng, bề mặt sần và có tâm sẫm màu (hình 4.1). Trong canh trường 802, B. amyloliquefaciens NBRC 14141 phát triển làm đục canh trường và lắng cặn ở dạng vảy trắng.
Hình 4. 1. Kết quả kiểm tra đại thể vi khuẩn B. amyloliquefaciens NBRC 14141
Vi khuẩn hình que, bắt màu tím khi nhuộm Gram (hình 4.2A), dài 2 μm khi chụp dưới kính hiển vi điện tử quét (hình 4.2B).
(A) (B)
Hình 4. 2. Kiểm tra vi thể bằng nhuộm Gram (A) và chụp bằng kính hiển vi điện tử quét (B)
Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của R. Borriss và cộng sự (2011): B.
amyloliquefaciens là vi khuẩn Gram dương, 0,7-0,9 x 1,8-3,0 μm, kết lại với nhau thành chuỗi.
Đối với loài phụ B. amyloliquefaciens subp. plantarum SP 1901 trong nghiên cứu của Trịnh Thành Trung và cộng sự (2013), khi nuôi trên môi trường thạch NA, lồi phụ này cũng hình thành khuẩn lạc trịn, trắng sữa; bề mặt khuẩn lạc khô, lồi và sần sùi; mép khuẩn lạc có hình răng cưa; kích thước khoảng 0,9-1,0 × 3,2-3,9 μm.
4.1.2. Kiểm tra định tính enzyme amylase và protease
B. amyloliquefaciens NBRC 14141 có khả năng sinh amylase và protease
ngoại bào thể hiện qua việc tạo vịng phân giải trên mơi trường thạch - tinh bột (hình 4.3) và mơi trường BCG - casein (hình 4.4).
Phương pháp của Archana Lal và Naowarat Cheeptham (2013) được sử dụng để kiểm tra khả năng sinh enzyme amylase của vi khuẩn: tiến hành cấy điểm trên môi trường thạch - tinh bột trong 96 giờ. Đường kính vịng phân giải trung bình từ 0,6 - 0,73 cm và khơng có sự khác biệt giữa các thời điểm đo là 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ. Chúng tôi nhận thấy vi khuẩn có khả năng sinh enzyme khá sớm khi khảo sát ở thời điểm 6 giờ, đường kính vịng phân giải đo được khi nhuộm Lugol là 0,43 cm.
(A) (B)
Hình 4. 3. Kết quả kiểm tra định tính amylase trên mơi trường thạch - tinh bột
Khả năng sinh enzyme protease được kiểm tra trên các thạch đĩa BCG-casein, ủ ở 37oC giờ theo phương pháp của phương pháp của Ponnuswamy Vijayaraghavan và Samuel Gnana Prakash Vincent (2013). Kết quả tại thời điểm 48 giờ, đường kính vịng phân giải là 1,47 cm. Ngồi ra, chúng tơi có tiến hành khảo sát tại thời điểm 6 giờ sau khi ủ, vòng phân giải xuất hiện với đường kính 0,27 cm. Theo thời gian, đường kính vịng phân giải càng tăng; kết thúc khảo sát tại thời điểm 96 giờ, đường kính vịng phân giải đạt 2,6 cm.
Hình 4. 4. Kết quả kiểm tra định tính protease trên mơi trường BCG-casein
Kỹ thuật khuếch tán trên thạch thường được áp dụng để xác định khả năng có sinh enzyme ngoại bào của vi sinh vật trong các thí nghiệm khảo sát ban đầu. Trong nghiên cứu của Ngô Tự Thành và cộng sự (2007), kỹ thuật khuếch tán trên thạch được dùng để xác định hoạt tính protease, amylase và cellulase (CMC-ase) của các chủng Bacillus phân lập. Các chủng Bacillus tạo vòng phân giải trên thạch đĩa được xác định là có sinh enzyme ngoại bào và được thăm dò khả năng ứng dụng xử lý nước thải sông Tô Lịch và nước thải nhà máy Vinamilk Gia Lâm - Hà Nội.
Nguyễn Hữu Hiệp và Nguyễn Thị Hải Lý (2012) khi phân lập 23 dòng vi khuẩn từ mẫu nước ao làng nghề sản xuất bột tại Đồng Tháp cũng dùng kỹ thuật khuếch tán trên thạch đĩa để đo vòng phân giải; chọn ra những dịng vi khuẩn có tỷ lệ D/d > 1,1 để thử khả năng xử lý nước thải chứa tinh bột.
4.2. Khảo sát đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens NBRC 14141 trong môi trường 802 và môi trường huấn luyện thích nghi
Khi ni lắc trong canh trường 802 với chế độ 150 vòng/phút, mật số B. amyloliquefaciens NBRC 14141 phát triển theo hướng pha thích nghi diễn ra trong
thời gian rất ngắn, pha tăng sinh từ trước 6 giờ đến 24 giờ, pha ổn định từ 24 đến trước 60 giờ, pha suy vong bắt đầu từ sau 60 giờ (hình 4.5). Trong thí nghiệm, chúng tơi sử dụng canh trường 802 để hoạt hóa vi khuẩn sau đó cấy chuyền qua canh trường 802 với tỷ lệ 1:100 để khảo sát đường cong sinh trưởng. Việc sử dụng cùng một môi trường 802 giúp cho vi khuẩn tăng sinh nhanh, nên giai đoạn thích nghi diễn ra trong thời gian rất ngắn. Thời điểm tối ưu để thu sinh khối vi khuẩn khi nuôi trong canh trường 802 là 24 giờ.
Hình 4. 5. Đường cong sinh trưởng của B. amyloliquefaciens NBRC 14141 trong môi trường 802
Tuy nhiên, khi B. amyloliquefaciens NBRC 14141 được nuôi trong canh trường nước thải hủ tiếu khử trùng (được sử dụng làm mơi trường huấn luyện thích nghi), các pha sinh trưởng diễn ra theo chiều hướng khác. Kết quả đếm mật số trên thạch đĩa cho thấy B. amyloliquefaciens NBRC 14141 có pha thích nghi từ 0 đến 6
giờ, pha tăng sinh kéo dài từ 6 đến trước 36 giờ, pha ổn định từ 36 đến 84 giờ và
hiện các thí nghiệm tiếp theo nên tiến hành vào thời điểm 36 giờ là lúc vi khuẩn đạt mật số cao nhất và tiết kiệm thời gian và chi phí ni lắc.
Hình 4. 6. Đường cong sinh trưởng của B. amyloliquefaciens NBRC 14141 trong môi trường huấn luyện thích nghi.
H., Cao và cộng sự (2013) khi nghiên cứu chủng B. amyloliquefaciens G1
nuôi trong canh trường thịt luộc NB (nutrient broth) và dịch huyền phù vi khuẩn được đo OD660. Kết quả nghiên cứu đường cong sinh trưởng của B. amyloliquefaciens G1 do H., Cao cơng bố có một số điểm không tương đồng với
kết quả của chúng tơi: pha thích nghi từ 0 đến 6 giờ, pha tăng sinh từ 6 đến 24 giờ, pha ổn định từ 24 đến 90 giờ và pha suy vong bắt đầu từ sau 90 giờ.
Chúng tôi nhận thấy, tùy đặc tính của mơi trường ni và chủng loại B. amyloliquefaciens, các chủng vi khuẩn này sẽ có các pha sinh trường khác nhau,
tương thích với từng mơi trường. Vì vậy, khảo sát đường cong sinh trưởng của vi khuẩn đối với từng môi trường nuôi là cần thiết; để xác định các thời điểm phù hợp cho việc thu sinh khối hoặc thu các hợp chất mong muốn.