Thành phần chủ yếu của loại nước thải này chứa các tạp chất hữu cơ ở dạng hòa tan hoặc lơ lửng, trong đó chủ yếu là các hợp chất carbohydrat như tinh bột, đường, các loại acid hữu cơ (acid lactic) (Nguyễn Hữu Hiệp và Nguyễn Thị Hải Lý, 2012). Nếu chất thải này thải trực tiếp vào nguồn nước mà khơng được xử lý thích hợp, thì quá trình phân hủy sinh học sẽ làm suy kiệt oxy hịa tan của nguồn nước, gây ơ nhiễm mơi trường nghiêm trọng. Các chỉ tiêu cơ bản trong nước thải được trình bày ở bảng 2.4. Tẻ bột dạng gel Gạo làm sạch Ngâm 24 giờ Xay Ngâm hỗn hợp bột nước 48 giờ Tráng Rửa chua Bao PE, Bao PP Phơi 3-4 giờ Giằng, ép Cắt sợi Đóng gói Thành phẩm Pha chế
Bảng 2.4. Thành phần nước thải của các cơ sở sản xuất bánh hủ tiếu tại làng nghề
STT Chỉ tiêu Đơn vị Kết quả
So sánh QCVN 40:2011/BTNMT (loại B) 1 pH - 4,35 - 7,53 5,5 - 9 2 TSS mg/l 49 - 354,8 100 3 BOD5 mg/l 60 - 1.200 50 4 COD mg/l 115 - 2297 150 5 Ntổng mg/l 7,85 - 121,1 40 6 Ptổng mg/l 1,51 - 14,1 6 7 Coliforms MPN/100 mL 7.103 - 9,2.105 5.103
(Nguồn: Trung tâm Kỹ thuật và Công nghệ sinh học- Sở Khoa học và Công nghệ Tiền Giang, năm 2013 và 2014)
Theo kết quả phân tích trên, đa phần các chỉ tiêu trong nước thải không đạt theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về nước thải loại B (QCVN 40:2011/BTNMT). Nồng độ COD thấp và tỷ số COD/BOD của nước thải xấp xỉ 1,91, thỏa điều kiện để áp dụng phương pháp xử lý sinh học hiếu khí (tỷ số COD/BOD ≤ 2) ( Nguyễn Văn Phước, 2012).
CHƯƠNG 3. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Nguyên liệu 3.1.1. Nguồn nước thải 3.1.1. Nguồn nước thải
Nước thải thu từ cơ sở sản xuất bánh hủ tiếu ở xã Mỹ Phong, thành phố Mỹ Tho-Tiền Giang tại ống thoát của bể rửa chua;
Nước thải được trữ 4oC khi chưa sử dụng (Sumathi K. M. Saminathan và cộng sự, 2013) và kiểm tra pH, COD, Phospho tổng số, Nitơ tổng số và NaCl trước khi sử dụng.
3.1.2. Giống vi sinh vật
Vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens NBRC 14141 dạng giống đông khô được cung cấp bởi Trung tâm Chủng vi sinh - địa chỉ: p403, Tòa nhà 7D, 239/34, Lạc Long Quân, Cầu Giấy, Hà Nội.
Thành phần môi trường nuôi cấy của chủng vi khuẩn này được thể hiện trong bảng 3.1. Bảng 3.1. Thành phần môi trường 802 Thành phần Hàm lượng Pepton 10 g Cao nấm men 2 g MgSO4.7H2O 1 g Nước cất 1 L Agar (nếu cần) 15 g pH=7,0
3.2. Vật liệu, thiết bị - dụng cụ và hóa chất 3.2.1. Vật liệu làm đệm lọc 3.2.1. Vật liệu làm đệm lọc
Đệm lọc là tre.
o Tre có độ xốp 0,69 m3/m3, bề mặt riêng 240 m2/m3 (Trịnh Văn Dũng, 2005).
Tre được cắt thành miếng nhỏ với kích thước 1 x 1 x 0,1 cm; được luộc và xả nước nhiều lần, phơi khô và hấp khử trùng trước khi sử dụng.
3.2.2. Thiết bị - dụng cụ
Tủ cấy vô trùng Telstar BIO-II-A; Tủ ủ vi sinh vật Memmert;
Máy lắc UniTwist 300;
Máy bơm Life Tech AP 4500; Máy nén khí Air Pump Resun; Máy đo pH SI Analytics Lab 850;
Lưu lượng kế đo lưu lượng khí: PF-40-400-NLPM-Air-SS-B3; Micropipette 100 μL, 1.000 μL;
Que cấy vi sinh;
Ống thủy tinh (φ100, dài 1m).
3.2.3. Hóa chất
Hóa chất pha mơi trường 802:
o Pepton; o Cao nấm men; o MgSO4.7H2O. Hóa chất chuẩn pH: o NaOH. o HCl.
Bộ thuốc nhuộm Gram:
o Cồn 95%;
o Lugol;
o Crystal violet;
o Safranine.
Hóa chất kiểm tra định tính amylase:
o Cao thịt bị;
o Tinh bột;
o Agar;
Hóa chất kiểm tra định tính protease: o Cao thịt bị; o Cao nấm men; o Natri clorua; o Agar; o BCG; o Casein.
Các hóa chất thử nghiệm COD, Nitơ tổng, Phospho tổng, Clorua.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp thực nghiệm cổ điển (thay đổi giá trị của một yếu tố khảo sát và cố định giá trị của các yếu tố còn lại) được áp dụng để thực hiện các thí nghiệm trong luận văn.
3.3.1. Sơ đồ nghiên cứu
Hình 3. 1. Sơ đồ nghiên cứu
Kiểm tra hoạt tính amylase và protease
Giống vi khuẩn
B. amyloliquefaciens
Kiểm tra đại thể và vi thể
Cấy chuyền tăng sinh khối
Cố định vi khuẩn lên đệm lọc trong tháp lọc sinh học
Khảo sát lưu lượng nước và lưu lượng khí tối ưu đối với hiệu quả xử lý COD Khảo sát ảnh hưởng của
tỷ lệ vi khuẩn bổ sung đến hiệu quả xử lý COD nước thải với tế bào tự do
Huấn luyện thích nghi
Nước thải pha loãng, pH = 7
Xây dựng đường cong sinh trưởng Nước thải khử trùng, pH = 7 Mơi trường 802, pH = 7 Quy trình xử lý nước thải hủ tiếu quy mơ phịng thí
3.3.2. Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu
3.3.2.1. Kiểm tra đại thể, vi thể và xây dựng đường cong sinh trưởng của vi khuẩn B. amyloliquefaciens NBRC 14141 khuẩn B. amyloliquefaciens NBRC 14141
Các đặc tính của giống vi khuẩn B. amyloliquefaciens NBRC 14141 được
kiểm tra lại trước khi sử dụng cho các thí nghiệm xử lý nước thải, và xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng vi khuẩn này để xác định các thời điểm thu sinh khối nhiều nhất.
Các bước tiến hành như sau:
Hoạt hóa B. amyloliquefaciens NBRC 14141 từ ống giống đơng khô bằng cách cấy trang lên môi trường thạch 802.
Kiểm tra khả năng sinh enzyme amylase và protease bằng kỹ thuật khuếch tán trên đĩa thạch - tinh bột và BCG-casein.
Cấy điểm trên môi trường thạch 802, ủ ở 37oC trong 24 giờ để kiểm tra đại thể; nuôi lắc trong canh trường 802 để kiểm tra vi thể bằng phương pháp nhuộm Gram và chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử qt.
Trữ giống bằng mơi trường thạch nghiêng 802, trữ ở 4oC; 2 - 3 tuần cấy chuyền một lần.
Xây dựng đường cong sinh trưởng:
o Dùng canh trường 802 hoạt hóa vi khuẩn từ môi trường thạch trữ giống.
o Khảo sát đường cong sinh trưởng ở 2 môi trường: canh trường 802 và canh trường nước thải hủ tiếu khử trùng - sử dụng làm mơi trường huấn luyện thích nghi. Cấy chuyền vi khuẩn từ canh trường hoạt hóa sang canh trường khảo sát với tỷ lệ 1:100, nuôi lắc (150 vịng/phút) trong thời gian thí ngiệm từ 0 - 96 giờ (H., Cao và cộng sự, 2013).
o Cách 6 giờ hút mẫu kiểm tra mật số 1 lần bằng kỹ thuật đếm số khuẩn lạc trên môi trường thạch 802.
3.3.2.2. Xử lý nước thải hủ tiếu bằng B. amyloliquefaciens NBRC 14141 tự do
Mục đích: xác định khả năng xử lý nước thải hủ tiếu của B. amyloliquefaciens NBRC 14141 thông qua việc so sánh giá trị COD đầu vào và COD sau khi xử lý.
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ bổ sung vi khuẩn (5 - 10 - 15 % v/v) đối với sự biến đổi COD theo thời gian (từ 12 - 48 giờ) đối với các giá trị COD đầu vào là 600 - 750 - 900 mg/l.
Các mẫu thử nghiệm được lắc liên tục trên máy lắc và định kỳ 12 giờ rút mẫu xác định hiệu quả xử lý bằng cách xác định giá trị COD sau khi đã để lắng 1,5 giờ (Trương Thị Mỹ Khanh và cộng sự, 2012).
¾ Thí nghiệm 1: CODđầu vào= 600 mg/l
Thông số cố định:
x Giá trị pH = 7.
x Thể tích xử lý: V = 0,5 lít;
x Chế độ máy lắc: 150 vịng/phút.
Thơng số khảo sát: Tỷ lệ canh trường huấn luyện thích nghi (% v/v) được thay đổi lần lượt là: 0% - 5% - 10% - 15% so với thể tích nước thải xử lý. Hàm mục tiêu: giá trị pH, COD.
¾ Thí nghiệm 2: CODđầu vào= 750 mg/l
Thông số cố định:
x Giá trị pH = 7.
x Thể tích xử lý: V = 0,5 lít;
x Chế độ máy lắc: 150 vịng/phút.
Thơng số khảo sát: Tỷ lệ canh trường huấn luyện thích nghi (% v/v) được thay đổi lần lượt là: 0% - 5% - 10% - 15% so với thể tích nước thải xử lý. Hàm mục tiêu: giá trị pH, COD.
¾ Thí nghiệm 3: CODđầu vào= 900 mg/l
Thông số cố định:
x Giá trị pH = 7.
x Thể tích xử lý: V = 0,5 lít;
x Chế độ máy lắc: 150 vịng/phút.
Thơng số khảo sát: Tỷ lệ canh trường huấn luyện thích nghi (% v/v) được thay đổi lần lượt là: 0% - 5% - 10% - 15% so với thể tích nước thải xử lý.
Hàm mục tiêu: giá trị pH, COD.
3.3.2.3. Xử lý nước thải hủ tiếu bằng B. amyloliquefaciens NBRC 14141 cố định trong tháp lọc sinh học
¾ Xây dựng mơ hình tháp lọc sinh học:
Sử dụng ống thủy tinh cao 1 m, đường kính 0,1 m; Cho đệm lọc (tre) vào trong lòng ống thủy tinh;
o Chiều cao chứa đệm lọc: 0,83 m
o Dưới đáy ống thủy tinh có lưới chặn để ngăn đệm lọc rơi ra ngoài.
Máy thổi khí gắn với ưu lượng kế để đo lưu lượng khí; ống dẫn khí nối với phần phễu bên dưới ống thủy tinh, trong lịng phễu có tấm chắn đục nhiều lỗ để phân tán khí vào trong tháp lọc.
o Bên ngồi phễu có gắn 4 ống để lấy khơng khí tự nhiên. Khi thí nghiệm dùng máy thổi khí, 4 ống này được bịt kín lại.
Dùng máy bơm nước trong thùng chứa từ dưới lên và dùng pét phun để điều chỉnh lượng nước chảy vào tháp lọc ở dạng tia nước nhỏ; phân phối nước từ trên xuống.
¾ Cố định vi khuẩn lên đệm lọc (Giai đoạn thích nghi):
Cho nước thải hủ tiếu pha loãng (COD = 150 mg/l, pH = 7) có bổ sung 10% (v/v) mơi trường hoạt hóa chứa B. amyloliquefaciens NBRC 14141 chảy nhẹ từ đỉnh tháp lọc qua vật liệu đệm trong 2 tuần (Sumathi K. M. Saminathan, 2013).
Thơng khí tự nhiên.
¾ Giai đoạn tiền xử lý:
Sau 2 tuần, tăng nồng độ COD trong nước thải pha loãng (COD = 600 mg/l, pH = 7) và bơm qua tháp lọc với lưu lượng 2,8 l/giờ.
Thơng khí tự nhiên.
Theo dõi COD đầu ra mỗi ngày, khi COD đầu ra ổn định giữa 3 lần lấy mẫu liên tiếp (Nguyễn Thanh Trúc và cộng sự, 2013) thì tiến hành các thí nghiệm khảo sát.
¾ Giai đoạn xử lý:
Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ thổi khí đối với hiệu quả xử lý nước thải ứng với các tốc độ bơm nước thải vào tháp lọc.
Thực hiện lọc 01 lần và xử lý theo từng mẻ.
Thí nghiệm 4: Thông số cố định:
x pH nước thải: được trung hòa đến pH = 7.
x COD đầu vào: 600 mg/l.
x Lưu lượng nước: 2,8 l/giờ
Thơng số khảo sát: Lưu lượng khí được thay đổi lần lượt là: 0-50-100-150 l/phút.
Hàm mục tiêu: giá trị pH, COD.
Thí nghiệm 5: Thông số cố định:
x pH nước thải: được trung hòa đến pH = 7.
x COD đầu vào: 600 mg/l.
x Lưu lượng nước: 3,2 l/giờ
Thơng số khảo sát: Lưu lượng khí được thay đổi lần lượt là: 0-50-100-150 l/phút.
Hàm mục tiêu: giá trị pH, COD.
Thí nghiệm 6: Thơng số cố định:
x pH nước thải: được trung hòa đến pH = 7.
x COD đầu vào: 600 mg/l.
x Lưu lượng nước: 3,6 l/giờ
Thông số khảo sát: Lưu lượng khí được thay đổi lần lượt là: 0-50-100-150 l/phút.
¾ So sánh hiệu quả xử lý với tháp lọc sinh học không bổ sung vi khuẩn B. amyloliquefaciens NBRC 14141.
Các giá thể tre trong tháp lọc được thay mới.
Cho nước thải hủ tiếu pha lỗng - khơng bổ sung B. amyloliquefaciens NBRC 14141chảy nhẹ qua giá thể.
Thực hiện các giai đoạn thích nghi và tiền xử lý với các điều kiện và thời gian giống như thí nghiệm có bổ sung B. amyloliquefaciens NBRC 14141. Giai đoạn xử lý:
Thí nghiệm 7:
9 Thông số cố định:
x pH nước thải: được trung hòa đến pH = 7.
x COD đầu vào: 600 mg/l.
x Lưu lượng nước: được chọn từ các thí nghiệm trên.
x Lưu lượng khí: được chọn từ các thí nghiệm trên.
9 Hàm mục tiêu: giá trị pH, COD; so sánh với hiệu quả của tháp lọc có bổ sung B. amyloliquefaciens NBRC 14141.
3.4. Phương pháp nghiên cứu hình thái vi khuẩn
Sử dụng phương pháp nhuộm của Christian Gram:
Theo phương pháp nhuộm Gram, vết bôi vi khuẩn được tạo ra, làm khơ và hơ nóng nhẹ để tế bào vi khuẩn dính chắc vào bề mặt phiến kính. Sau đó, vết bơi được nhuộm với crystal violet, thuốc nhuộm dư được rửa trôi rồi thêm dung dịch iodine vào vết bôi. Iodine làm nhiệm vụ gắn chất màu vào tế bào. Tiếp theo, vết bôi được khử màu bởi cồn và được nhuộm lại với safranin. Ở tế bào vi khuẩn Gram dương, màu tím của crystal violet được gắn chắc vào lớp vỏ tế bào nhờ iodine, khơng bị khử bởi cồn và vì thế mà tế bào vi khuẩn vẫn mang màu tím. Trái lại màu tím ở tế bào vi khuẩn Gram âm bị khử bởi cồn và tế bào không màu lại bắt với màu hồng của safranin (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2006).
3.5. Phương pháp xác định mật số vi sinh vật
Định lượng gián tiếp tế bào vi sinh vật bằng phương pháp đếm số khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch.
Dùng micropippete lấy 0,05 mL dịch huyền phù vi sinh vật ở các nồng độ pha loãng khác nhau cho vào đĩa thạch; mỗi nồng độ pha loãng lặp lại 3 lần.
Dùng que cấy thủy tinh vô khuẩn để dàn đều các tế bào trên bề mặt thạch, để cho bề mặt thạch khô, đặt úp ngược đĩa và đem đĩa vào trong tủ ấm. Khi kết thúc thời gian ủ đếm số khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch.
Số lượng tế bào vi sinh vật trong 1 mL mẫu được tính theo cơng thức sau (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2006):
Số tế bào
= n.D ml mẫu v
n: Số khuẩn lạc trung bình của 3 đĩa Petri ở một nồng độ pha loãng nhất định.
D: Hệ số pha loãng. V: Dịch mẫu đem cấy.
3.6. Phương pháp kiểm tra định tính enzyme amylase và protease 3.6.1. Kiểm tra định tính enzyme amylase 3.6.1. Kiểm tra định tính enzyme amylase
Hoạt tính enzyme phân giải tinh bột do vi sinh vật tiết ra được kiểm tra trên môi trường thạch - tinh bột theo phương pháp của Archana Lal và Naowarat Cheeptham (2013): một khuẩn lạc riêng biệt được cấy ria hoặc cấy điểm trên mặt thạch đĩa; thành phần môi trường được trình bày ở bảng 3.2. Các đĩa cấy được ủ ở 37oC trong 24 - 48 giờ (hoặc lâu hơn, 3 - 5 ngày).
Bảng 3.2. Thành phần môi trường thạch - tinh bột
Thành phần Đơn vị Hàm lượng
Cao thịt bò g/L 3 Tinh bột hòa tan g/L 10
Agar g/L 12
Nước cất L 1,0
Kết thúc quá trình ủ, mặt thạch đĩa được nhuộm với dung dịch iodine. Sự kết hợp giữa tinh bột và iodine làm xuất hiện màu xanh đen. Nếu xung quanh khuẩn lạc có vịng phân giải màu sáng chứng tỏ có sự thủy phân tinh bột bởi vi sinh vật do sự tiết enzyme ngoại bào.
3.6.2. Kiểm tra hoạt tính enzyme protease
Hoạt tính enzyme phân giải protein do vi sinh vật tiết ra được kiểm tra trên môi trường thạch đĩa BCG (Bromocresol green reagent) - casein theo phương pháp của Ponnuswamy Vijayaraghavan và Samuel Gnana Prakash Vincent (2013): Vi khuẩn được cấy điểm trên môi trường thạch đĩa với các thành phần như ở bảng 3.3. Các đĩa cấy được ủ ở 37oC trong 48 giờ. Sự phân giải protein sẽ tạo ra vòng phân giải màu sáng trên thạch đĩa.
Bảng 3.3. Thành phần môi trường thạch đĩa BCG - casein
Thành phần Đơn vị Hàm lượng Cao thịt bò g/L 1,5 Cao nấm men g/L 1,5 Natri clorua g/L 5,0 Agar g/L 15 Casein g/L 10 BCG % (w/v) 0,0015 Nước cất L 1,0 pH = 7
3.7. Các phương pháp phân tích hóa lý 3.7.1. Xác định pH 3.7.1. Xác định pH
Việc xác định pH được tiến hành theo các chỉ dẫn của tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6492:2011 (ISO 10523: 2008).
Nguyên tắc: Việc xác định giá trị pH dựa trên việc đo hiệu điện thế của pin điện hóa khi dùng một pH - mét phù hợp. pH của mẫu cũng phụ thuộc vào nhiệt độ của trạng thái cân bằng điện giải. Do vậy, nhiệt độ của mẫu luôn luôn được ghi cùng với phép đo giá trị pH.
3.7.2. Xác định nhu cầu oxy hóa học (COD)
Kiểm nhu cầu oxy hóa học bằng phương pháp đun hồn lưu kín (SWEWW 5220 C).
Nguyên tắc: Hầu hết các chất hữu cơ đều bị phân hủy khi đun sôi trong hỗn