M: Marker (100pb
Kết quả BLAST các chủng đ
phản ánh tính chính xác của việc định danh s Kết quả giải trình t
tương đồng trên Genbank cho th đoạn 16S rDNA của chủng
được định danh là Enterobacter cloacae
đồng 98% so với đoạn 16S r được định danh là Clostridium tương đồng 100% so v
đó chủng này được định danh đồng 100% so với đoạn 1
M (-)
ẩm PCR sau khi tinh sạch sẽ được gửi đi để giải trình t
ết quả điện di genome và sản phẩm nhân bản gen mã hóa 16s rRNA b ĩ thuật PCR, các mẫu kí hiệu và đánh số thứ tự như trong h
ơng có băng phụ, kích thước điện di sản phẩm khoảng 1500bp, ớc của đoạn gen mã hóa 16S rARN của vi khuẩn.
ết quả điện di sản phẩm nhân bản gen 16S rDNA b PCR
(100pb-1kb); (-): Đối chứng âm; (+): Đối chứng d
ết quả BLAST các chủng được hiển thị trong Bảng 3.3. Kết quả n ản ánh tính chính xác của việc định danh sơ bộ theo khóa phân loại Bergey.
ình tự khi so sánh với các trình tự gen 16S rD ên Genbank cho thấy: Chủng CB1 có tỉ lệ tương đ
ủa chủng Enterobacter cloacae MCE64A9 trên ngân hàng gen và
Enterobacter cloacae CB1. Chủng vi khuẩn CB2 có độ t ới đoạn 16S rDNA của chủng Clostridium sp. JC2
Clostridium sp.CB2, chưa đủ cơ sở định danh đến lo
so với đoạn 16S rDNA của chủng Clostridium beijerinckii ợc định danh là Clostridium beijerinckii CB3. Chủng
ới đoạn 16S rDNA của chủng Clostridium bifermentans
) (+) CB1 CB2 CB3 CT4 CT5 ình tự gen mã hóa 16S ã hóa 16s rRNA bằng ư trong hình có băng rõ nét, ản phẩm khoảng 1500bp, ủa vi khuẩn. NA bằng kĩ thuật
ối chứng âm; (+): Đối chứng dương.
ợc hiển thị trong Bảng 3.3. Kết quả này đã ộ theo khóa phân loại Bergey.
ự gen 16S rDNA của các loài ương đồng 99% so với ên ngân hàng gen và ủng vi khuẩn CB2 có độ tương JC272, do đó chủng này ở định danh đến lồi. Chủng CB3 Clostridium beijerinckii PS3, do ủng CT4 có hệ tương Clostridium bifermentans DPH – 1 1500bp
và được định danh là Clostridium bifermentans CT4. Chủng CT5 có hệ số tương đồng 99% với đoạn 16S rDNA của chủng Clostridium bifermentans ATCC 638 và được định danh là Clostridium bifermentans CT5.
Bảng 3.3: Kết quả định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử Ký hiệu Ký hiệu
chủng Tên chủng trên ngân hàng Gen
Tỉ lệ tương đồng (%)
CB1 Enterobacter cloacae MCE64A9 99%
CB2 Clostridium sp. JC272 98%
CB3 Clostridium beijerinckii PS3 100%
CT4 Clostridium bifermentans DPH-1 100%
CT5 Clostridium bifermentans ATCC 638 99%
Chủng CB1: kết quả phân tích trình tự 16S rDNA và kết quả thử nghiệm dựa vào khóa phân loại Bergey cho thấy chủng CB1 thuộc loài Enterobacter cloacae.
Đây là chi được biết đến là nhóm trực khuẩn hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện, Gram âm có khả năng sử dụng nguồn glucose lên men sinh hydro [58]. Phản ứng citrate và catalase dương tính, có khả năng di động là điểm tương đồng với Enterobacter cloacae [58]. Chủng vi khuẩn này đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu trước đó
như nghiên cứu của Harun Irrina và cộng sự (2012) [31].
Chủng CB2: dựa theo kết quả phân tích trình tự rDNA 16s và kết quả thử nghiệm dựa vào khóa phân loại Bergey cho thấy chủng CB2 thuộc chi Clostridium. Là vi khuẩn Gram dương, hình que, catalase âm tính, có khả năng hình thành bào tử là những đặc điểm điển hình của chi Clostridium. Chủng này có phản ứng citrate âm tính là đặc điểm của hầu hết các loài thuộc chi này [80]. Chủng khơng có khả năng di động tương đồng với một số loài trong chi. Cùng với kết quả phân tích trình tự rDNA 16s chúng tôi kết luận chủng thuộc chi Clostridium, chưa đủ dữ liệu để định danh đến loài.
Chủng CB3: dựa vào các phương pháp định danh cho thấy chủng CB3 thuộc loài Clostridium beijerinckii - vi khuẩn Gram dương hình que, có khả năng sinh bào tử, lên men sinh hydro, catalase âm tính [80]. Chủng CB3 có khả năng di động, đây cũng là điểm tương đồng với Clostridium beijerinckii [57]. Chủng này có phản ứng citrate và indole âm tính cũng là điểm trùng khớp với Clostridium beijerinckii.
Ngoài ra chủng CB3 được phân lập từ phân bò, đây cũng là nguồn nguyên liệu giàu
Chủng CT4 và CT5: kết quả phân tích trình tự 16S rDNA và kết quả thử nghiệm dựa vào khóa phân loại Bergey 2 chủng thuộc lồi Clostridium bifermentans. Chúng cũng có những đặc điểm đặc trưng của chi Clostridium như đã
trình bày ở trên. Khác với Clostridium beijerinckii, cả hai chủng này đều có phản
ứng indole dương tính. Đây cũng là điểm tương đồng với Clostridium bifermentans [80]. Trong 2 chủng này, chủng CT4 có khả năng di động, trong khi chủng CT5 lại khơng có khả năng này. Điều này cũng tượng tự với nghiên cứu của Katarzyna Leja và cộng sự (2014) [42] khi nghiên cứu các đặc điểm sinh hóa của một số chủng
Clostridium bifermentans, cho thấy trong cùng một lồi thì tính chất sinh hóa cũng
có thể khơng đồng nhất. Trên thế giới Clostridium bifermentans đã được sử dụng để nghiên cứu sinh hydro trong nhiều năm qua [81, 82].
Các kết quả trên chỉ ra tính chính xác và sự trùng khớp giữa định danh bằng kĩ thuật sinh học phân tử phân tích trình tự gen mã hóa 16S rDNA và khóa phân loại Bergey. Kết hợp với các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và sinh học phân tử, từ đó chúng tơi có thể khẳng định rằng những kết quả định danh các chủng vi khuẩn sinh hydro là hồn tồn chính xác.
3.1.4. Định danh lồi bằng khối phổ Protein
Các mẫu đã được định danh bằng 2 phương pháp trên được chúng tơi kiểm định tính chính xác một lần nữa bằng phương pháp khối phổ protein với kết quả như sau:
- Các chủng CB1, CB3, CT4, CT5 được định danh lần lượt là Enterobacter cloacae, Clostridium beijerinckii, Clostridium bifermentans. Kết quả này hoàn toàn
trùng khớp với 2 phương pháp sử dụng khóa định loại Bergey và phân tích trình tự gen 16S rDNA.
- Chủng CB2 khơng xác định được do khơng có dữ liệu trong máy phân tích. Như vậy kết hợp 3 phương pháp định danh trên, có thể kết luận rằng kết quả phân lập và định danh các chủng vi khuẩn có khả năng sinh hydro của chúng tơi là hồn tồn chính xác, có độ tin cậy cao.
3.2. Khảo sát các điều kiện tối ưu sinh hydro
3.2.1. Khả năng sinh trưởng và sinh khí của các chủng vi khuẩn
Từ các chủng đã được phân lập và định danh, chúng tôi tập trung nghiên cứu và tuyển chọn các chủng có khả năng sinh khí hydro cao nhất.
Các chủng vi khuẩn đ ở nhiệt độ 350C, pH = 7 Bảng 3.4: S Chủng vi khuẩn CB1 CB2 CB3 CT4 CT5
Dựa vào kết quả tr khả năng sinh trưởng
OD 1,301. Theo The Prokaryotes volum 4, Bacte
Clostridium beijerinckii
nhất trong chi Clostridium
trước đó. Theo Tanisho, 1987 1mol H2/ mol glucose
Clostridium beijerinckii
chúng tơi tiến hành kh
và sinh khí hydro của chủng CB3 CB3).
Hình 3.4: Khả năng sinh tr
ủng vi khuẩn đã được phân lập sẽ được nuôi cấy trong môi tr pH = 7,0, tốc độ lắc 150 rpm, thời gian 48 giờ.
ng 3.4: Sản lượng hydro từ các chủng phân l
ủng vi khuẩn Sản lượng hydro(ml/L môi trường) OD 600 115,89 ± 4,69 0,423 ± 0,014 120,89± 5,34 0,428 ± 0,015 469,94 ± 7,56 1,301 ± 0,031 315,21 ± 13,67 0,950 ± 0 234,21 ± 16,73 0,756 ± 0,
ết quả trên cho thấy chủng CB3 là Clostridium beijerinckii và sinh hydro cao nhất đạt 469,94 ml/L môi tr
The Prokaryotes volum 4, Bacteria: Fimicutes, cyanobacteria,
Clostridium beijerinckii là một trong những chủng có khả năng sin
Clostridium. Kết quả này cũng trùng khớp với một số nghi
Tanisho, 1987 Enterobacter aerogens E.2005 đ
/ mol glucose [72]. Một nghiên cứu của Dan An v
beijerinckii YA001 cho sản lượng 2.3 mol H2 / mol glucose
ành khảo sát tối ưu hóa các điều kiện ảnh hưởng tới sự sinh tr ủa chủng CB3 (Clostridium beijerinckii CB3
ả năng sinh trưởng trở lại và hình thái tế b
beijerinckii CB3
ấy trong môi trường PY
ng phân lập OD 600 0,423 ± 0,014 0,428 ± 0,0150 1,301 ± 0,0310 950 ± 0,026 0,756 ± 0,009 Clostridium beijerinckii CB3 có
mơi trường tại giá trị ria: Fimicutes, cyanobacteria, ột trong những chủng có khả năng sinh khí hydro cao ớp với một số nghiên cứu E.2005 đạt sản lượng hydro ứu của Dan An và cộng sự cho thấy / mol glucose [12]. Do đó ởng tới sự sinh trưởng CB3 – C. beijerinckii
3.2.2. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng và sinh khí
Tiến hành thí nghiệm nghiên cứu khả năng sinh trưởng và sinh khí hydro của chủng trong thời gian từ 0 đến 72 giờ. Khi nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến khả năng phát triển và sinh hydro của chủng, có kết quả như sau:
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của thời gian tới khả năng sinh trưởng và sinh khí
Kết quả cho thấy quá trình sinh trưởng và tạo khí đi liền với nhau, có nghĩa là khi tế bào tăng trưởng thì cũng sản sinh ra khí [5]. Theo bảng trên ta thấy theo thời gian nuôi cấy sinh khối tế bào tăng dần đi cùng với sản lượng hydro tăng theo. Tại thời điểm từ 0 – 6 giờ sinh khối tế bào tặng chậm OD tăng từ 0,032-0,094 và lượng khí hydro sinh ra ít đạt từ 0 – 10,83 ml/L môi trường. Sau 12 giờ lượng khí bắt đầu tăng nhanh. Từ 12 – 36 giờ lượng khí sinh ra tăng từ 40,38- 365,13 ml/L môi trường, sau đó tăng chậm hơn và đạt cực đại tại 48 giờ với sản lượng hydro thu được 581,63 ml/L mơi trường tại giá trị OD 1,469. Điều này có thể lý giải do tế bào
Thời gian (giờ) Sản lượng hydro (ml/L môi trường) OD 600 0 0 0,032 ± 0 6 10,83 ± 0,21 0,094 ± 0,019 12 40,38 ± 3,98 0,291 ± 0,022 18 141,02 ± 6,7 0,513 ± 0,025 24 245,25 ± 12,4 0,735 ± 0,035 30 286,57 ± 2,42 0,856 ± 0,015 36 365,13 ± 11,57 1,014 ± 0,042 42 452,94 ± 3,26 1,244 ± 0,049 48 581,63 ± 5,24 1,469 ± 0,028 54 447,72 ± 6,53 1,157 ± 0,014 60 344,29 ± 2,44 0,974 ± 0,058 66 274,55 ± 16,76 0,801 ± 0,029 72 197,36 ± 4,25 0,733 ± 0,012
bước vào giai đoạn sinh trưởng nhanh, sinh khối tế bào tăng mạnh đi cùng với quá trình trao đổi chất tăng cao, hàm lượng khí sinh ra tăng đột biến. Sau 48 giờ hàm lượng khí sinh ra giảm có thể do chất dinh dưỡng trong tế bào đã cạn kiệt, tế bào bước vào pha suy vong, nguồn cacbon tích lũy trong tế bào đã bị phân hủy để duy trì sự sinh trưởng của vi khuẩn, hydro có thể kết hợp với chất khác và tham gia vào con đường biến dưỡng khác. Ngoài ra do áp suất riêng phần của hydro tăng lên làm cho q trình chuyển hóa tạo ra nhiều sản phẩm phụ khác như ethanol, lactate, alanine làm giảm hiệu suất sinh hydro. Điều này cho thấy thời gian tối ưu nhất để chủng sinh trưởng và sinh khí hydro là 48 giờ.