ứu thí nghiệm được thể hiện dưới hình 2.1 d
ên cứu phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh hydro
u và ni cấy
ẫu thu thập được pha lỗng trong nước cất, lọc qua giấy lọc để loại ỏ các tạp chất. Đem tiền xử lý mẫu bằng máy gia nhiệt ở 100
ờng sẽ được cho vào bình serum 15ml sau ên ngồi.
ủa bình serum được sục khí N2 tinh khiết để loại bỏ hết O ằm tạo mơi trường kị khí. Khi mơi trường trở lên trong su
ượng chuyển sang màu hồng của thuốc thử àm giàu chủng.
• Thu mẫu phân gia súc từ một số tỉnh miền Bắc • Ni cấy mẫu trong bình serum
hydro sinh ra từ mỗi mẫu, chọn các mẫu cho sản lượng hydro cao (ml/L môi trường)
hử sinh hydro
• Phân lập các vi sinh vật kị khí mẫu được chọn và định danh loại Bergey kết hợp kĩ thuật sinh đo quang phổ protein
và định danh
• Xác định lại khả năng sinh chủng đã phân lập, định danh, hydro cao nhất
vi sinh vật kị khí cao nhất
• Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng trưởng và sinh hydro đối với được lựa chọn
Tối ưu các điều kiện sinh
• Ni cấy và xác định khả năng sinh khí hydro theo thời gian lựa chọn
Thử nghiệm trên nguồn sản- phụ phẩm nơng nghiệp: bã
đậu và bột ngơ
• Ni cấy trong các bình Clostridium được chọn với vi xem xét khả năng sinh khí
Ni cấy kết hợp các chủng vi sinh phân lập được
ình 2.1 dưới đây:
ển chọn chủng vi khuẩn sinh hydro
ớc cất, lọc qua giấy lọc để loại ỏ các tạp chất. Đem tiền xử lý mẫu bằng máy gia nhiệt ở 1000 C trong 30 phút
ào bình serum 15ml sau đó được đóng nắp
ết để loại bỏ hết O2 ên trong suốt và lắc lên ốc thử thì mơi trường đã u phân gia súc từ một số tỉnh miền Bắc
m, xác định lượng hydro sinh ra từ mỗi mẫu, chọn các mẫu cho sản
(ml/L mơi trường)
khí sinh hydro trong danh bằng khóa định sinh học phân tử và
hydro cao của các danh, chọn ra chủng sinh hưởng tới quá trình sinh với chủng sinh hydro năng sinh trưởng và gian với chủng được bình serum chủng
Hình 2.2: Phương pháp sục khí nitơ
- Cấy giống từ 5-10% (v/v) khi vẫn đang tiến hành sục khí N2.
- Cuối cùng cho bình serum đã cấy vào bể lắc ổn nhiệt và nuôi cấy ở 35oC, 150 rpm.
- Sau 2 ngày nuôi cấy chọn những mẫu có khả năng sinh khí hydro cao cấy chuyển sang bình làm giàu lần thứ hai và thứ ba để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
- Lấy dịch nuôi cấy lần thứ 3 pha loãng, cấy trải trên đĩa thạch mơi trường PYA trong tủ ni cấy kị khí.
- Sau 24- 48 giờ, quan sát và lựa chọn những khuẩn lạc to, riêng rẽ nuôi lại kiểm tra khả năng sinh H2.
- Từ các đĩa Petri, chúng tôi chọn được các khuẩn lạc riêng rẽ dựa vào đặc điểm khác nhau về hình dáng, kích thước, màu sắc, bề mặt, mép, độ lồi. Sau đó chúng tơi đã ni thuần chủng tinh khiết và giữ giống phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.3.2. Định danh vi khuẩn dựa vào khóa định loại Bergey
Các chủng thuần khiết phân lập được sẽ được thử nghiệm về hình thái, tính chất sinh lý, sinh hóa. Mặc dù phương pháp này khơng hồn tồn chính xác nhưng đây là bước đầu tiên trong nghiên cứu phân loại vi sinh vật. Các thí nghiệm được thực hiện như sau [2]:
Nhuộm Gram
Nhuộm Gram là phương pháp thực nghiệm hữu hiệu trong bước đầu tiên xác định vi sinh vật, phân biệt các lồi vi khuẩn thành hai nhóm Gram dương và Gram âm dựa trên các đặc tính lý hóa của thành tế bào.
Khả năng sinh bào tử
Xác định khả năng sinh bào tử bằng phương pháp sốc nhiệt. Vi khuẩn có khả năng sinh hydro được nuôi trong mơi trường ni cấy 1- 2 ngày. Sau đó đem dịch ni cấy ủ trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 85oC trong 15 phút. Dịch nuôi cấy sau khi sốc nhiệt được nuôi cấy lại. Nếu thấy vi khuẩn sinh trưởng trở lại và có khả năng tạo khí thì vi khuẩn có khả năng sinh hydro đó có khả năng tạo bào tử.
Thử nghiệm Catalase
Catalase là enzyme có khả năng phân hủy hydrogen peroxide (H2O2) thành nước (H2O) và oxy (O2). Các thử nghiệm catalase nhằm phát hiện ra sự có mặt các enzyme catalase trong vi khuẩn, nó là thử nghiệm cần thiết để phân biệt catalase âm và catalase dương tính.
Thử nghiệm khả năng di động
Để xác định khả năng di động của vi khuẩn, cấy khuẩn lạc đâm sâu vào môi trường thạch mềm (0,5% agar) trong ống nghiệm, khoảng 2/3 độ dài thạch. Ủ ở 37oC từ 18- 24 giờ. Phản ứng dương tính vi khuẩn di động sẽ làm môi trường đục, sinh trưởng lan ra khỏi vết cấy. Phản ứng âm tính vi khuẩn chỉ sinh trưởng quanh đường cấy, môi trường không bị đục.
Thủy phân gelatinese
Xác định khả năng sinh enzyme gelatinese làm tan chảy môi trường gelatin. Để phân giải ngoại bào gelatin, các vi khuẩn này phải có khả năng sinh enzyme ngoại bào gelatinese. Chủng vi khuẩn được cấy riêng rẽ vào ống nghiệm. Ủ vi khuẩn ở 37oC trong điều kiện kỵ khí. Sau 5 - 7 ngày lấy các ống nghiệm đặt vào tủ nhiệt độ 4oC 1- 2 giờ ở nhiệt độ thấp gelatin sẽ đơng lại. Nếu gelatin bị thủy phân thì môi trường tan chảy, môi trường ở dạng rắn chứng tỏ gelatin không bị thủy phân.
Thử nghiệm Indole
Vi khuẩn có enzyme tryptophanase có khả năng thủy phân axit amin tryptophan sinh indol, axit pyruvic và NH3+. Indol sinh ra sẽ kết hợp với nhóm
(CHO)- của p-dimethylaminobenzaldehyd có trong thuốc thử Kovac hình thành nên phức hợp màu đỏ.
Thử nghiệm hoạt tính Lecithinase
Trộn lịng trắng trứng với cùng trọng lượng nước muối sinh lý tạo thành dịch huyền phù. Lấy 10ml dịch huyền phù trên hòa tan vào môi trường thạch- peptone đã khử trùng, đổ đĩa petri. Cấy vi khuẩn thành điểm trên đĩa thạch đặt ở 37oC. Nếu xung quanh và dưới vết cấy có vạch trong là phản ứng dương tính (+), ngược lại phản ứng âm tính (-).
Thử nghiệm Urease
Ure là diamid của axit carbonic dễ bị thủy phân bởi enzyme urease tạo thành amoniac và carbon dioxide, chất chỉ thị pH là phenol đỏ. Phenol đỏ chuyển sang màu hồng trong môi trường kiềm. Kết quả dương tính (+) khi mơi trường chuyển sang màu hồng, âm tính (-) mơi trường khơng đổi màu.
Đồng hóa Citrate
Thử nghiệm xác định khả năng vi sinh vật sử dụng nguồn nitrat như là nguồn carbon duy nhất. Vi sinh vật sử dụng citrate sinh CO2 làm kiềm môi trường. Vi sinh vật sử dụng muối amonium là nguồn đạm duy nhất tạo ra NH3 làm kiềm hóa mơi trường. Phản ứng dương tính (+) mơi trường chuyển sang màu xanh, âm tính (-) mơi trường khơng thay đổi màu sắc.
Thử nghiệm Oxidase
Thử nghiệm nhằm phát hiện khả năng sinh enzyme cytochrome oxidase của vi khuẩn. Hệ thống cytochrome có ở vi khuẩn hoạt động như chất liên kết trong q trình hơ hấp. Phản ứng sử dụng thuốc thử tetramethyl p-phenylenediamine dihydrochloride. Phản ứng dương tính (+) có màu xanh tím, phản ứng âm tính (-) khơng có xuất hiện màu.
Thử nghiệm Methyl red (MR)
Thử nghiệm nhằm phát hiện vi sinh vật sản xuất và duy trì các axit bền trong quá trình lên men glucose. Sử dụng chất chỉ thị methyl red. Phản ứng dương tính (+) càng kéo dài thời gian ni cấy, mơi trường càng axit, phản ứng âm tính (-) các chất có tính axit bị chuyển hóa, mơi trường dần trung tính.
Thử nghiệm VP
Thử nghiệm phát hiện vi sinh vật tạo sản phẩm trung tính (acetoin) trong quá trình lên men glucose. Acetoin được tạo ra trong điều kiện kỵ khí hồn tồn. Phản ứng dương tính (+) mơi trường có màu hồng, phản ứng âm tính (-) mơi trường khơng đổi màu.
2.3.3. Định danh chủng sinh khí hydro dựa vào giải trình tự đoạn gen rDNA 16S
Tách chiết và tinh sạch DNA
Tách chiết và tinh sạch DNA sử dụng bộ kit “Magpure Bacteria DNA Kit” của ANABIO Research & Development. Kiểm tra chất lượng DNA là bước cần thiết trong quy trình tách chiết DNA, DNA tinh sạch được phân tích bằng cách điện di trên gel agarose 1%, nhuộm bởi EtBr và được quan sát bằng ánh sáng UV.
PCR khuếch đại đoạn 16S rDNA
Sau khi tinh sạch genome, đoạn gen mã hóa 16S rRNA được khuếch đại bằng cặp mồi 27F và 1527R. 27F 1527R 5’-AGAGTTTGATAMTGGCTCAG-3’ 5’-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3’ Thành phần PCR (tổng thể tích 30µl/phản ứng): 10x buffer: ADN mẫu (100- 200 ng/µl: 27Fw (10 pmol): 1527Rv (10 pmol): dNTP: H2O: 3 µl 4 µl 1,5 µl 1,5 µl 3 µl 16,3 µl
Chu trình nhiệt cho PCR:
94°C 5 phút 94°C 30 giây 62°C 45 giây 72°C 90 giây 72°C 5 phút 4°C ∞
Sản phẩm sau PCR được điện di kiểm tra bằng gel agarrose 1%, so sánh với DNA ladder 1kb, nhuộm bởi EtBr và được quan sát bằng ánh sáng UV.
Tinh sạch sản phẩm PCR:
Sản phẩm PCR được tinh sạch theo bộ kit “Anapure PCR product” của ANABIO Research & Development. Sản phẩm PCR tinh sạch được điện di kiểm tra bằng gel agarose 1%, nhuộm bởi EtBr và quan sát bằng ánh sáng UV. Băng có kích thước khoảng 1500bp là sản phẩm tương ứng với vùng trình tự của rDNA ở vi khuẩn.
Giải trình tự sản phẩm PCR và phân tích dữ liệu:
Các mẫu DNA tinh sạch từ sản phẩm PCR được giải trình tự. Các trình tự DNA sau đó được phân tích bằng phần mềm Chromas và DNA club, sau đó so sánh với dữ liệu có sẵn trong Ngân hàng gen của NCBI (GenBank) sử dụng chương trình BLAST nhằm tìm ra chủng có trình tự gần nhất với tỷ lệ tương đồng tương ứng, tên chủng vi khuẩn được đặt tên, định danh dựa vào kết quả BLAST. Các dữ liệu liên quan được trích xuất ở dạng FASTA để phục vụ cho phân tích phát sinh chủng loại.
2.3.4. Định danh bằng khối phổ Protein
Các mẫu khuẩn lạc thuần khiết được đem đi định danh vi sinh vật bằng dấu ấn phân tử.
Maldi Biotyper (Bruker Daltonics, Mỹ) sử dụng công nghệ khối phổ protein - MALDITOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight) định danh vi sinh vật bằng dấu ấn phân tử. So sánh sự tương đồng của phổ protein từ mẫu vi sinh vật mục tiêu với cơ sở dữ liệu của gần 6000 chủng vi sinh vật khác nhau, Maldi Biotyper cho phép định danh chính xác loài vi sinh vật, bao gồm vi khuẩn G+, G-, vi khuẩn kỵ khí, hiếu khí, nấm men, Mycobacter, nấm sợi.