Ký hiệu
chủng Tên chủng trên ngân hàng Gen
Tỉ lệ tương đồng (%)
CB1 Enterobacter cloacae MCE64A9 99%
CB2 Clostridium sp. JC272 98%
CB3 Clostridium beijerinckii PS3 100%
CT4 Clostridium bifermentans DPH-1 100%
CT5 Clostridium bifermentans ATCC 638 99%
Chủng CB1: kết quả phân tích trình tự 16S rDNA và kết quả thử nghiệm dựa vào khóa phân loại Bergey cho thấy chủng CB1 thuộc loài Enterobacter cloacae.
Đây là chi được biết đến là nhóm trực khuẩn hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện, Gram âm có khả năng sử dụng nguồn glucose lên men sinh hydro [58]. Phản ứng citrate và catalase dương tính, có khả năng di động là điểm tương đồng với Enterobacter cloacae [58]. Chủng vi khuẩn này đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu trước đó
như nghiên cứu của Harun Irrina và cộng sự (2012) [31].
Chủng CB2: dựa theo kết quả phân tích trình tự rDNA 16s và kết quả thử nghiệm dựa vào khóa phân loại Bergey cho thấy chủng CB2 thuộc chi Clostridium. Là vi khuẩn Gram dương, hình que, catalase âm tính, có khả năng hình thành bào tử là những đặc điểm điển hình của chi Clostridium. Chủng này có phản ứng citrate âm tính là đặc điểm của hầu hết các loài thuộc chi này [80]. Chủng khơng có khả năng di động tương đồng với một số loài trong chi. Cùng với kết quả phân tích trình tự rDNA 16s chúng tôi kết luận chủng thuộc chi Clostridium, chưa đủ dữ liệu để định danh đến loài.
Chủng CB3: dựa vào các phương pháp định danh cho thấy chủng CB3 thuộc loài Clostridium beijerinckii - vi khuẩn Gram dương hình que, có khả năng sinh bào tử, lên men sinh hydro, catalase âm tính [80]. Chủng CB3 có khả năng di động, đây cũng là điểm tương đồng với Clostridium beijerinckii [57]. Chủng này có phản ứng citrate và indole âm tính cũng là điểm trùng khớp với Clostridium beijerinckii.
Ngoài ra chủng CB3 được phân lập từ phân bò, đây cũng là nguồn nguyên liệu giàu
Chủng CT4 và CT5: kết quả phân tích trình tự 16S rDNA và kết quả thử nghiệm dựa vào khóa phân loại Bergey 2 chủng thuộc lồi Clostridium bifermentans. Chúng cũng có những đặc điểm đặc trưng của chi Clostridium như đã
trình bày ở trên. Khác với Clostridium beijerinckii, cả hai chủng này đều có phản
ứng indole dương tính. Đây cũng là điểm tương đồng với Clostridium bifermentans [80]. Trong 2 chủng này, chủng CT4 có khả năng di động, trong khi chủng CT5 lại khơng có khả năng này. Điều này cũng tượng tự với nghiên cứu của Katarzyna Leja và cộng sự (2014) [42] khi nghiên cứu các đặc điểm sinh hóa của một số chủng
Clostridium bifermentans, cho thấy trong cùng một lồi thì tính chất sinh hóa cũng
có thể khơng đồng nhất. Trên thế giới Clostridium bifermentans đã được sử dụng để nghiên cứu sinh hydro trong nhiều năm qua [81, 82].
Các kết quả trên chỉ ra tính chính xác và sự trùng khớp giữa định danh bằng kĩ thuật sinh học phân tử phân tích trình tự gen mã hóa 16S rDNA và khóa phân loại Bergey. Kết hợp với các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và sinh học phân tử, từ đó chúng tơi có thể khẳng định rằng những kết quả định danh các chủng vi khuẩn sinh hydro là hồn tồn chính xác.
3.1.4. Định danh lồi bằng khối phổ Protein
Các mẫu đã được định danh bằng 2 phương pháp trên được chúng tơi kiểm định tính chính xác một lần nữa bằng phương pháp khối phổ protein với kết quả như sau:
- Các chủng CB1, CB3, CT4, CT5 được định danh lần lượt là Enterobacter cloacae, Clostridium beijerinckii, Clostridium bifermentans. Kết quả này hoàn toàn
trùng khớp với 2 phương pháp sử dụng khóa định loại Bergey và phân tích trình tự gen 16S rDNA.
- Chủng CB2 khơng xác định được do khơng có dữ liệu trong máy phân tích. Như vậy kết hợp 3 phương pháp định danh trên, có thể kết luận rằng kết quả phân lập và định danh các chủng vi khuẩn có khả năng sinh hydro của chúng tơi là hồn tồn chính xác, có độ tin cậy cao.
3.2. Khảo sát các điều kiện tối ưu sinh hydro
3.2.1. Khả năng sinh trưởng và sinh khí của các chủng vi khuẩn
Từ các chủng đã được phân lập và định danh, chúng tôi tập trung nghiên cứu và tuyển chọn các chủng có khả năng sinh khí hydro cao nhất.
Các chủng vi khuẩn đ ở nhiệt độ 350C, pH = 7 Bảng 3.4: S Chủng vi khuẩn CB1 CB2 CB3 CT4 CT5
Dựa vào kết quả tr khả năng sinh trưởng
OD 1,301. Theo The Prokaryotes volum 4, Bacte
Clostridium beijerinckii
nhất trong chi Clostridium
trước đó. Theo Tanisho, 1987 1mol H2/ mol glucose
Clostridium beijerinckii
chúng tơi tiến hành kh
và sinh khí hydro của chủng CB3 CB3).
Hình 3.4: Khả năng sinh tr
ủng vi khuẩn đã được phân lập sẽ được nuôi cấy trong môi tr pH = 7,0, tốc độ lắc 150 rpm, thời gian 48 giờ.
ng 3.4: Sản lượng hydro từ các chủng phân l
ủng vi khuẩn Sản lượng hydro(ml/L môi trường) OD 600 115,89 ± 4,69 0,423 ± 0,014 120,89± 5,34 0,428 ± 0,015 469,94 ± 7,56 1,301 ± 0,031 315,21 ± 13,67 0,950 ± 0 234,21 ± 16,73 0,756 ± 0,
ết quả trên cho thấy chủng CB3 là Clostridium beijerinckii và sinh hydro cao nhất đạt 469,94 ml/L môi tr
The Prokaryotes volum 4, Bacteria: Fimicutes, cyanobacteria,
Clostridium beijerinckii là một trong những chủng có khả năng sin
Clostridium. Kết quả này cũng trùng khớp với một số nghi
Tanisho, 1987 Enterobacter aerogens E.2005 đ
/ mol glucose [72]. Một nghiên cứu của Dan An v
beijerinckii YA001 cho sản lượng 2.3 mol H2 / mol glucose
ành khảo sát tối ưu hóa các điều kiện ảnh hưởng tới sự sinh tr ủa chủng CB3 (Clostridium beijerinckii CB3
ả năng sinh trưởng trở lại và hình thái tế b
beijerinckii CB3
ấy trong môi trường PY
ng phân lập OD 600 0,423 ± 0,014 0,428 ± 0,0150 1,301 ± 0,0310 950 ± 0,026 0,756 ± 0,009 Clostridium beijerinckii CB3 có
mơi trường tại giá trị ria: Fimicutes, cyanobacteria, ột trong những chủng có khả năng sinh khí hydro cao ớp với một số nghiên cứu E.2005 đạt sản lượng hydro ứu của Dan An và cộng sự cho thấy / mol glucose [12]. Do đó ởng tới sự sinh trưởng CB3 – C. beijerinckii
3.2.2. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng và sinh khí
Tiến hành thí nghiệm nghiên cứu khả năng sinh trưởng và sinh khí hydro của chủng trong thời gian từ 0 đến 72 giờ. Khi nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến khả năng phát triển và sinh hydro của chủng, có kết quả như sau:
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của thời gian tới khả năng sinh trưởng và sinh khí
Kết quả cho thấy quá trình sinh trưởng và tạo khí đi liền với nhau, có nghĩa là khi tế bào tăng trưởng thì cũng sản sinh ra khí [5]. Theo bảng trên ta thấy theo thời gian nuôi cấy sinh khối tế bào tăng dần đi cùng với sản lượng hydro tăng theo. Tại thời điểm từ 0 – 6 giờ sinh khối tế bào tặng chậm OD tăng từ 0,032-0,094 và lượng khí hydro sinh ra ít đạt từ 0 – 10,83 ml/L môi trường. Sau 12 giờ lượng khí bắt đầu tăng nhanh. Từ 12 – 36 giờ lượng khí sinh ra tăng từ 40,38- 365,13 ml/L môi trường, sau đó tăng chậm hơn và đạt cực đại tại 48 giờ với sản lượng hydro thu được 581,63 ml/L mơi trường tại giá trị OD 1,469. Điều này có thể lý giải do tế bào
Thời gian (giờ) Sản lượng hydro (ml/L môi trường) OD 600 0 0 0,032 ± 0 6 10,83 ± 0,21 0,094 ± 0,019 12 40,38 ± 3,98 0,291 ± 0,022 18 141,02 ± 6,7 0,513 ± 0,025 24 245,25 ± 12,4 0,735 ± 0,035 30 286,57 ± 2,42 0,856 ± 0,015 36 365,13 ± 11,57 1,014 ± 0,042 42 452,94 ± 3,26 1,244 ± 0,049 48 581,63 ± 5,24 1,469 ± 0,028 54 447,72 ± 6,53 1,157 ± 0,014 60 344,29 ± 2,44 0,974 ± 0,058 66 274,55 ± 16,76 0,801 ± 0,029 72 197,36 ± 4,25 0,733 ± 0,012
bước vào giai đoạn sinh trưởng nhanh, sinh khối tế bào tăng mạnh đi cùng với quá trình trao đổi chất tăng cao, hàm lượng khí sinh ra tăng đột biến. Sau 48 giờ hàm lượng khí sinh ra giảm có thể do chất dinh dưỡng trong tế bào đã cạn kiệt, tế bào bước vào pha suy vong, nguồn cacbon tích lũy trong tế bào đã bị phân hủy để duy trì sự sinh trưởng của vi khuẩn, hydro có thể kết hợp với chất khác và tham gia vào con đường biến dưỡng khác. Ngoài ra do áp suất riêng phần của hydro tăng lên làm cho q trình chuyển hóa tạo ra nhiều sản phẩm phụ khác như ethanol, lactate, alanine làm giảm hiệu suất sinh hydro. Điều này cho thấy thời gian tối ưu nhất để chủng sinh trưởng và sinh khí hydro là 48 giờ.
Hình 3.5: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng và sinh khí
3.2.3. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh trưởng và sinh khí
Nguồn cacbon có vai trò rất quan trọng trong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật nói chung và vi khuẩn sinh khí hydro nói riêng. Do đó chúng tơi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon khác nhau đến khả năng sinh trưởng và tạo khí hydro của chủng C. beijerinckii CB3.
Để lựa chọn nguồn cacbon tốt nhất cho quá trình sinh trưởng và tạo khí hydro chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng này trên nguồn 6 nguồn cacbon khác nhau là saccharose, mantose, glucose, cellulose, xylose, lactose sau đó theo dõi q trình sinh trưởng và sinh khí của chủng.
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 0 100 200 300 400 500 600 700 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 O D 6 0 0 S ả n l ư ợ n g ( m l)
Thời gian (giờ)
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh trưởng và sinh khí Các nguồn
cơ chất
Sản lượng hydro
(ml/L môi trường) OD600
Mantose 317,73 ± 6,25 0,958 ± 0,015 Saccharose 124,89 ± 4,62 0,431 ± 0,046 Cellulose 67,7 ± 1,21 0,319 ± 0,006 Glucose 602,31 ± 4,04 1,478 ± 0,053 Lactose 410,31 ± 8,32 1,122 ± 0,024 Xylose 60,21 ± 5,3 0,298 ± 0,039
Hình 3.6: Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh trưởng và sinh khí
Kết quả thí nghiệm cho thấy chủng C. beijerinckii CB3 có thể sinh trưởng và tạo khí khi trên cả trên cả 6 nguồn cacbon nghiên cứu với lượng khí hydro tạo ra dao động từ 60,21 – 602,31 ml/L môi trường. Tuy nhiên với mỗi nguồn cacbon khác nhau khả năng sinh trưởng và lượng khí hydro sinh ra cũng khác nhau. Khả năng sinh trưởng và lượng khí cao nhất thu được khi chủng này sinh trưởng trên cơ chất glucose và lactose. Với nguồn cơ chất glucose, giá trị OD đạt được là 1,478
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 0 100 200 300 400 500 600 700
Mantose Saccharose Cellulose Glucose Lactose Xylose
O D 6 0 0 S ả n l ư ợ n g ( m l) Nguồn Cacbon Sản lượng (ml) OD
cùng với sản lượng hydro sau 48 giờ nuôi cấy là 602,21 ml/L môi trường. Glucose tham gia trực tiếp vào quá trình đường phân tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình sinh trưởng của tế bào vi khuẩn, chủng phát triển nhanh và cho sản lượng hydro cao. Một số nghiên cứu trên thế giới cũng chỉ ra rằng glucose là nguồn cacbon ưa thích cho q trình sinh khí hydro. Kết quả trên tương đồng với một số nghiên cứu trước đó [29, 36]. Trong trường hợp của Citrobacter sp. CMC-1 sản lượng H2 từ glucose ở điều kiện tối ưu (pH 6,0 và 34°C) là 1,82 ± 0,02 mol H2/ mol glucose [46]. Nhiều nghiên cứu trên Clostridium beijerinckii cũng cho sản lượng hydro cao. Theo nghiên cứu của Xin Zhao và cộng sự, 2011 chủng vi khuẩn C. beijerinckii
RZF -1108 mới được phân lập tại điều kiện pH =7,0, t0c=350C cho sản lượng hydro 1,97 mol H2/ mol glucose, 2209 ml H2/ l môi trường [88].
Lactose là một disaccharide gồm glucose và galactose. Nó cũng được xem là chất nền tốt cho sản xuất hydro. Được ứng dụng cho việc sản xuất khí hydro từ chất thải và nước thải từ ngành công nghiệp sữa. Theo nghiên cứu của Dan An và cộng sự, 2014 chủng Clostridium beijerinckii YA001 khi sử dụng lactose làm nguồn cơ chất đạt sản lượng hydro 58,9 ml/ g cơ chất. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng mantose cũng là nguồn cơ chất tương đối thích hợp với q trình sản xuất hydro. Sản lượng hydro đạt 40,9 ml/ g cơ chất [12]. Kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu của chúng tôi. Các nguồn cơ chất saccharose, cellulose, xylose không phải là nguồn cơ chất thích hợp cho lên men sản xuất hydro của C. beijerinckii CB3 có thể do bản chất của chúng hoặc sự vắng mặt của các enzyme chuyển hóa trong chủng phân lập.
Từ kết quả thí nghiệm chúng tơi lựa chọn glucose cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.4. Ảnh hưởng của hàm lượng glucose tới khả năng sinh trưởng và sinh khí
Sau khi chọn được nguồn cacbon là glucose, chúng tôi tiến hành xác định nồng độ glucose tối ưu cho quá trình sinh trưởng và tạo khí của chủng C. beijerinckii CB3. Hàm lượng glucose bổ sung đầu vào khác nhau: 2, 4, 6, 8, 10, 12,
14 g/l với tỉ lệ tiếp giống 10 % xem xét sự sinh trưởng và tạo thành khí hydro sau 48 giờ nuôi cấy.
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của hàm lượng glucose tới khả năng sinh trưởng và sinh khí Hàm lượng
glucose (g/l)
Sản lượng hydro
(ml/L môi trường) OD600
2 37,82 ± 2,14 0,289 ± 0,008 4 82,06 ± 1,25 0,350± 0,012 6 183,08 ± 7,92 0,712 ± 0,026 8 338,76 ± 12,53 0,973 ± 0,046 10 600,70 ± 8,22 1,475 ± 0,051 12 445,37 ± 4,15 1,142 ± 0,034 14 227,21 ± 9,52 0,727 ± 0,018
Kết quả thí nghiệm chỉ ra nồng độ glucose ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và tạo khí của chủng C. beijerinckii CB3. Khả năng tăng trưởng và sản lượng khí tạo ra tăng cùng với sự tăng hàm lượng glucose từ 2-10 g/l đạt từ 37,82-600,70 ml/L môi trường cùng với sinh khối tăng từ OD 0,289-1,475. Khi hàm lượng glucose thấp 2g/l thì vi khuẩn sử dụng nhanh lượng khí tạo thành thấp chỉ đạt 37,82 ml/L môi trường. Khi glucose được bổ sung vào mơi trường với hàm lượng tăng dần, nó được sử dụng làm nguồn cơ chất trực tiếp cho quá trình sinh trưởng và tạo khí hydro, sinh khối và lượng khí hydro tăng nhanh và đạt cực đại trong môi trường chứa hàm lượng glucose 10g/l. Sinh trưởng của chủng và lượng khí sinh ra giảm dần khi hàm lượng glucose tăng lên 12g/l. Việc sử dụng lượng glucose quá nhiều vi khuẩn tiêu thụ khơng hết sẽ gây lãng phí. Đồng thời lượng cơ chất sử dụng và pH cuối cùng giảm với sự gia tăng hàm lượng glucose có thể là ngun nhân gây giảm lượng khí sinh ra khi hàm lượng glucose tăng cao. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng tương tự với một số nghiên cứu trước đó trong nước và trên thế giới. Kết quả của nhóm nghiên cứu Đặng Thị Yến và các cộng sự, 2013 cũng cho kết quả lượng cơ chất tối ưu là 10g/l glucose đối với chủng Tr 2 [9] hay kết quả của nhóm nghiên cứu Alalayah và cộng sự 2009 [10]. Kết quả nghiên cứu của Xin Zhao và cộng sự, 2011 sản lượng hydro tối đa đạt được tại nồng độ glucose 9g/l khi thử nghiệm chủng C.
dụng 16g/l [15], C.butyricum EB6 sử dụng 15.7 g/l [21] thì lượng glucose C. beijerinckii CB3 sử dụng cho hàm lượng khí hydro cao nhất thấp hơn khá nhiều, giúp tiết kiệm được nguyên liệu và chi phí đầu vào nhiều hơn.
Hình 3.7: Ảnh hưởng của hàm lượng glucose đến khả năng sinh trưởng và sinh khí
3.2.5. Ảnh hưởng nguồn nitơ tới khả năng sinh trưởng và sinh khí
Nguồn nitơ có vai trị quan trọng đối với q trình phát triển và tạo khí của vi khuẩn. Trong điều kiện quy mơ phịng thí nghiệm, chúng tơi đã tiến hành nghiên cứu khả năng sinh trưởng và sinh hydro của chủng vi khuẩn C. beijerinckii CB3 thông qua khả năng sử dụng các nguồn nitơ gồm nitơ hữu cơ (pepton, cao men và cao thịt) và nguồn nitơ vô cơ (NH4Cl, NH4NO3) để tìm ra nguồn nitơ thích hợp giúp ni cấy chủng vi khuẩn này đạt sản lượng hydro cao nhất.
Bảng 3.8: Ảnh hưởng của các nguồn Nitơ tới khả năng sinh trưởng và sinh khí
Nguồn Nitơ Sản lượng hydro
(ml/L môi trường) OD600
BM+Y 544,01 ± 9,67 1,456 ± 0,028