- Cấy giống từ 5-10% (v/v) khi vẫn đang tiến hành sục khí N2.
- Cuối cùng cho bình serum đã cấy vào bể lắc ổn nhiệt và nuôi cấy ở 35oC, 150 rpm.
- Sau 2 ngày nuôi cấy chọn những mẫu có khả năng sinh khí hydro cao cấy chuyển sang bình làm giàu lần thứ hai và thứ ba để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
- Lấy dịch nuôi cấy lần thứ 3 pha loãng, cấy trải trên đĩa thạch môi trường PYA trong tủ ni cấy kị khí.
- Sau 24- 48 giờ, quan sát và lựa chọn những khuẩn lạc to, riêng rẽ nuôi lại kiểm tra khả năng sinh H2.
- Từ các đĩa Petri, chúng tôi chọn được các khuẩn lạc riêng rẽ dựa vào đặc điểm khác nhau về hình dáng, kích thước, màu sắc, bề mặt, mép, độ lồi. Sau đó chúng tơi đã ni thuần chủng tinh khiết và giữ giống phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.3.2. Định danh vi khuẩn dựa vào khóa định loại Bergey
Các chủng thuần khiết phân lập được sẽ được thử nghiệm về hình thái, tính chất sinh lý, sinh hóa. Mặc dù phương pháp này khơng hồn tồn chính xác nhưng đây là bước đầu tiên trong nghiên cứu phân loại vi sinh vật. Các thí nghiệm được thực hiện như sau [2]:
Nhuộm Gram
Nhuộm Gram là phương pháp thực nghiệm hữu hiệu trong bước đầu tiên xác định vi sinh vật, phân biệt các lồi vi khuẩn thành hai nhóm Gram dương và Gram âm dựa trên các đặc tính lý hóa của thành tế bào.
Khả năng sinh bào tử
Xác định khả năng sinh bào tử bằng phương pháp sốc nhiệt. Vi khuẩn có khả năng sinh hydro được nuôi trong mơi trường ni cấy 1- 2 ngày. Sau đó đem dịch ni cấy ủ trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 85oC trong 15 phút. Dịch nuôi cấy sau khi sốc nhiệt được nuôi cấy lại. Nếu thấy vi khuẩn sinh trưởng trở lại và có khả năng tạo khí thì vi khuẩn có khả năng sinh hydro đó có khả năng tạo bào tử.
Thử nghiệm Catalase
Catalase là enzyme có khả năng phân hủy hydrogen peroxide (H2O2) thành nước (H2O) và oxy (O2). Các thử nghiệm catalase nhằm phát hiện ra sự có mặt các enzyme catalase trong vi khuẩn, nó là thử nghiệm cần thiết để phân biệt catalase âm và catalase dương tính.
Thử nghiệm khả năng di động
Để xác định khả năng di động của vi khuẩn, cấy khuẩn lạc đâm sâu vào môi trường thạch mềm (0,5% agar) trong ống nghiệm, khoảng 2/3 độ dài thạch. Ủ ở 37oC từ 18- 24 giờ. Phản ứng dương tính vi khuẩn di động sẽ làm môi trường đục, sinh trưởng lan ra khỏi vết cấy. Phản ứng âm tính vi khuẩn chỉ sinh trưởng quanh đường cấy, môi trường không bị đục.
Thủy phân gelatinese
Xác định khả năng sinh enzyme gelatinese làm tan chảy môi trường gelatin. Để phân giải ngoại bào gelatin, các vi khuẩn này phải có khả năng sinh enzyme ngoại bào gelatinese. Chủng vi khuẩn được cấy riêng rẽ vào ống nghiệm. Ủ vi khuẩn ở 37oC trong điều kiện kỵ khí. Sau 5 - 7 ngày lấy các ống nghiệm đặt vào tủ nhiệt độ 4oC 1- 2 giờ ở nhiệt độ thấp gelatin sẽ đông lại. Nếu gelatin bị thủy phân thì mơi trường tan chảy, môi trường ở dạng rắn chứng tỏ gelatin không bị thủy phân.
Thử nghiệm Indole
Vi khuẩn có enzyme tryptophanase có khả năng thủy phân axit amin tryptophan sinh indol, axit pyruvic và NH3+. Indol sinh ra sẽ kết hợp với nhóm
(CHO)- của p-dimethylaminobenzaldehyd có trong thuốc thử Kovac hình thành nên phức hợp màu đỏ.
Thử nghiệm hoạt tính Lecithinase
Trộn lịng trắng trứng với cùng trọng lượng nước muối sinh lý tạo thành dịch huyền phù. Lấy 10ml dịch huyền phù trên hịa tan vào mơi trường thạch- peptone đã khử trùng, đổ đĩa petri. Cấy vi khuẩn thành điểm trên đĩa thạch đặt ở 37oC. Nếu xung quanh và dưới vết cấy có vạch trong là phản ứng dương tính (+), ngược lại phản ứng âm tính (-).
Thử nghiệm Urease
Ure là diamid của axit carbonic dễ bị thủy phân bởi enzyme urease tạo thành amoniac và carbon dioxide, chất chỉ thị pH là phenol đỏ. Phenol đỏ chuyển sang màu hồng trong môi trường kiềm. Kết quả dương tính (+) khi mơi trường chuyển sang màu hồng, âm tính (-) mơi trường khơng đổi màu.
Đồng hóa Citrate
Thử nghiệm xác định khả năng vi sinh vật sử dụng nguồn nitrat như là nguồn carbon duy nhất. Vi sinh vật sử dụng citrate sinh CO2 làm kiềm môi trường. Vi sinh vật sử dụng muối amonium là nguồn đạm duy nhất tạo ra NH3 làm kiềm hóa mơi trường. Phản ứng dương tính (+) mơi trường chuyển sang màu xanh, âm tính (-) mơi trường khơng thay đổi màu sắc.
Thử nghiệm Oxidase
Thử nghiệm nhằm phát hiện khả năng sinh enzyme cytochrome oxidase của vi khuẩn. Hệ thống cytochrome có ở vi khuẩn hoạt động như chất liên kết trong q trình hơ hấp. Phản ứng sử dụng thuốc thử tetramethyl p-phenylenediamine dihydrochloride. Phản ứng dương tính (+) có màu xanh tím, phản ứng âm tính (-) khơng có xuất hiện màu.
Thử nghiệm Methyl red (MR)
Thử nghiệm nhằm phát hiện vi sinh vật sản xuất và duy trì các axit bền trong quá trình lên men glucose. Sử dụng chất chỉ thị methyl red. Phản ứng dương tính (+) càng kéo dài thời gian ni cấy, mơi trường càng axit, phản ứng âm tính (-) các chất có tính axit bị chuyển hóa, mơi trường dần trung tính.
Thử nghiệm VP
Thử nghiệm phát hiện vi sinh vật tạo sản phẩm trung tính (acetoin) trong q trình lên men glucose. Acetoin được tạo ra trong điều kiện kỵ khí hồn tồn. Phản ứng dương tính (+) mơi trường có màu hồng, phản ứng âm tính (-) môi trường không đổi màu.
2.3.3. Định danh chủng sinh khí hydro dựa vào giải trình tự đoạn gen rDNA 16S
Tách chiết và tinh sạch DNA
Tách chiết và tinh sạch DNA sử dụng bộ kit “Magpure Bacteria DNA Kit” của ANABIO Research & Development. Kiểm tra chất lượng DNA là bước cần thiết trong quy trình tách chiết DNA, DNA tinh sạch được phân tích bằng cách điện di trên gel agarose 1%, nhuộm bởi EtBr và được quan sát bằng ánh sáng UV.
PCR khuếch đại đoạn 16S rDNA
Sau khi tinh sạch genome, đoạn gen mã hóa 16S rRNA được khuếch đại bằng cặp mồi 27F và 1527R. 27F 1527R 5’-AGAGTTTGATAMTGGCTCAG-3’ 5’-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3’ Thành phần PCR (tổng thể tích 30µl/phản ứng): 10x buffer: ADN mẫu (100- 200 ng/µl: 27Fw (10 pmol): 1527Rv (10 pmol): dNTP: H2O: 3 µl 4 µl 1,5 µl 1,5 µl 3 µl 16,3 µl
Chu trình nhiệt cho PCR:
94°C 5 phút 94°C 30 giây 62°C 45 giây 72°C 90 giây 72°C 5 phút 4°C ∞
Sản phẩm sau PCR được điện di kiểm tra bằng gel agarrose 1%, so sánh với DNA ladder 1kb, nhuộm bởi EtBr và được quan sát bằng ánh sáng UV.
Tinh sạch sản phẩm PCR:
Sản phẩm PCR được tinh sạch theo bộ kit “Anapure PCR product” của ANABIO Research & Development. Sản phẩm PCR tinh sạch được điện di kiểm tra bằng gel agarose 1%, nhuộm bởi EtBr và quan sát bằng ánh sáng UV. Băng có kích thước khoảng 1500bp là sản phẩm tương ứng với vùng trình tự của rDNA ở vi khuẩn.
Giải trình tự sản phẩm PCR và phân tích dữ liệu:
Các mẫu DNA tinh sạch từ sản phẩm PCR được giải trình tự. Các trình tự DNA sau đó được phân tích bằng phần mềm Chromas và DNA club, sau đó so sánh với dữ liệu có sẵn trong Ngân hàng gen của NCBI (GenBank) sử dụng chương trình BLAST nhằm tìm ra chủng có trình tự gần nhất với tỷ lệ tương đồng tương ứng, tên chủng vi khuẩn được đặt tên, định danh dựa vào kết quả BLAST. Các dữ liệu liên quan được trích xuất ở dạng FASTA để phục vụ cho phân tích phát sinh chủng loại.
2.3.4. Định danh bằng khối phổ Protein
Các mẫu khuẩn lạc thuần khiết được đem đi định danh vi sinh vật bằng dấu ấn phân tử.
Maldi Biotyper (Bruker Daltonics, Mỹ) sử dụng công nghệ khối phổ protein - MALDITOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight) định danh vi sinh vật bằng dấu ấn phân tử. So sánh sự tương đồng của phổ protein từ mẫu vi sinh vật mục tiêu với cơ sở dữ liệu của gần 6000 chủng vi sinh vật khác nhau, Maldi Biotyper cho phép định danh chính xác loài vi sinh vật, bao gồm vi khuẩn G+, G-, vi khuẩn kỵ khí, hiếu khí, nấm men, Mycobacter, nấm sợi.
2.4. Các phương pháp phân tích
- Xác định tổng khí biogas sinh ra
Tổng lượng khí sinh ra được xác định theo phương pháp thay thế nước (water displacement method) [72] (Hình 2.3), theo đó khí trong bình thí nghiệm sẽ theo đường dẫn số 6 vào trong ống đong và đẩy dần nước ra khỏi ống, lượng nước bị đẩy ra khỏi ống đong tương đương với lượng khí sinh ra trong bình phân hủy kỵ khí [8].
Hình 2.3: Nguyên lý của phương pháp cột nước xác định tổng lượng khí sinh ra từ bể phân hủy kỵ khí (Lettinga, 1995).
Chú thích:
1 - Bình phân hủy kỵ khí
2- Đường lấy mẫu phân tích COD 3 - Xylanh có khóa lấy khí phân tích H2 4 - Khóa đóng mở
5 - Ống đong đo cột nước
6 - Ống dẫn khí để xác định tổng lượng khí sinh ra qua sự chuyển động của cột nước [8].
- Định lượng khí hydro trong mơ hình thí nghiệm
Khí H2 trong headspace được lấy bởi gas-tight syringe và được xác định bằng máy sắc kí khí GC Aligent 7890A, được trang bị detector dẫn nhiệt TCD với phương pháp thử EDC VI-003 GC, nhiệt độ detector 1100C, nhiệt độ injector 1100C, nhiệt độ lò 1100C, khí mang Argon, tốc độ dịng 3ml/phút.
- Xác định hàm lượng khí hydro sinh ra
YH2 = A.V (ml/L môi trường), với A là phần trăm khí hydro, V là tổng thể tích khí sinh ra).
- Xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn bằng đo mật độ quang tế bào bằng phương pháp quang phổ bước sóng (opical density –OD600) đo bằng máy đo OD [1].
2.5. Nghiên cứu quá trình sản xuất hydro sinh học của chủng Clostridium sp.
Chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian, nguồn cơ chất, nồng độ cơ chất, nguồn nitơ, pH, nhiệt độ… lên sự phát triển và sinh hydro của chủng
2.5.1. Đánh giá khả năng sinh trưởng và sinh hydro của các chủng đã phân lập
Sau khi phân lập được các chủng có khả năng sinh khí, tiến hành ni trong bình serum và đánh giá khả năng sinh hydro của các chủng. Tiến hành sàng lọc lựa chọn ra chủng có khả năng sinh nhiều khí nhất để tối ưu hóa điều kiện tạo khí.
2.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng và sinh khí
Chủng vi khuẩn được ni trong bình serum chứa mơi trường PY. Tiến hành nghiên cứu khảo sát tại các thời điểm: 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72 giờ tại pH 7,0, T= 350C, tốc độ lắc 150rpm.
2.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cơ chất đến khả năng sinh trưởng và sinh khí
Tiến hành khảo sát trên 6 nguồn cacbon sau (10g/l): saccharose, mantose, glucose, cellulose, xylose, lactose. Các nguồn cơ chất này được cho vào môi trường PY, tiến hành nuôi cấy tại pH = 7,0. T= 350C, tốc độ lắc= 150rpm. Tiến hành đo OD và lượng hydro sinh ra sau 48 giờ nuôi cấy.
2.5.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến khả năng sinh trưởng và sinh khí sinh khí
Chọn nguồn cơ chất thích hợp nhất từ thí nghiệm trên tiến hành khảo sát tại các nồng độ 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 (g/l). Tại pH = 7,0. T= 350C, tốc độc lắc 150rpm. Tiến hành đo OD và lượng hydro sinh ra sau 48 giờ nuôi cấy.
2.5.5. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng và sinh khí
Tiến hành khảo sát với một số nguồn nitơ sau (10g/l): các nguồn nitơ hữu cơ gồm pepton (P), cao men (Y), cao thịt (M) và các nguồn nitơ vô cơ gồm NH4Cl, NH4NO3. Chúng được bổ sung vào môi cơ bản (BM) PY: BM+P (môi trường cơ bản và pepton), BM+Y (môi trường cơ bản và cao men), BM + PY (môi trường cơ bản kết hợp cao men và pepton), BM + NH4Cl (môi trường cơ bản và NH4Cl), BM+ NH4NO3 (môi trường cơ bản và NH4NO3). Tiến hảnh nuôi cấy dưới điều kiện glucose 10g/l, pH = 7,0, T= 350C, tốc độ lắc 150rpm. Tiến hành đo OD và lượng hydro sinh ra sau 48 giờ nuôi cấy.
2.5.6. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng và sinh khí
Tiến hành khảo sát nghiên cứu tại các điều kiện pH: 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9; 9,5 trong bình serum với nguồn cơ chất glucose 10g/l, pH = 7,0, T= 350C, tốc độ lắc 150rpm. Tiến hành đo OD và lượng hydro sinh ra sau 48 giờ nuôi cấy.
2.5.7. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng và sinh khí
Tiến hành nghiên cứu khảo sát ở các nhiệt độ: 25, 30, 35, 37, 40, 45, 500C trong bình serum với nguồn cơ chất glucose 10g/l, pH = 7,0, T= 350C, tốc độ lắc 150rpm. Tiến hành đo OD và khí hydro sinh ra sau 48 giờ ni cấy.
2.5.8. Khảo sát ảnh hưởng của muối Natri dến khả năng sinh trưởng và sinh khí
Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của muối NaHCO3 lên sự sinh trưởng và sinh khí hydro của chủng nghiên cứu. NaHCO3 được bổ sung vào môi trường với các nồng độ sau: 240, 320, 400, 480, 560, 640 mg/l, pH = 7,0 (pH được điều chỉnh bằng NaOH 1% hoặc H2SO4 1%), T= 350C, tốc độ lắc 150rpm. Tiến hành đo OD và lượng khí hydro sinh ra sau 48 giờ ni cấy.
2.5.9. Khảo sát ảnh hưởng của muối Kali đến khả năng sinh trưởng và sinh khí
Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của muối K2HPO4 lên sự sinh trưởng và sinh khí của chủng nghiên cứu. K2HPO4 được bổ sung vào môi trường với các nồng độ sau: 24, 32, 40, 48, 56, 64 mg/l, pH = 7,0 (pH được điều chỉnh bằng NaOH 1% hoặc H2SO4 1%), T= 350C, tốc độ lắc 150rpm. Tiến hành đo OD và lượng khí hydro sinh ra sau 48 giờ ni cấy.
2.5.10. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng sinh trưởng và sinh khí
Tiến hành khảo sát ở các tốc độ lắc khác nhau 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 rpm với môi trường nuôi cấy PY, glucose 10g/l, pH = 7,0, T= 350C. Tiến hành đo OD và lượng khí hydro sinh ra sau 48 giờ ni cấy.
2.6. Thăm dò một số nguồn sản – phụ phẩm nông nghiệp làm nguyên liệu đầu vào cho quá trình sản xuất hydro sinh học nhờ sự lên men của vi khuẩn kị khí ưa ấm Clostridium sp.
2.6.1. Nguồn cơ chất là bã đậu
Để xác định ảnh hưởng của cơ chất bã đậu đến sản lượng hydro, chủng nghiên cứu được nuôi cấy trong môi trường PY sử dụng cơ chất bã đậu thô và bã đậu đã qua tiền xử lý với nồng độ 10g/l. Đo OD và hàm lượng khí hydro sinh ra tại 0 đến 60 giờ nuôi cấy. Mỗi lần đo cách nhau 6 tiếng. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.6.2. Nguồn cơ chất là bột ngô
Để xác định ảnh hưởng của cơ chất bột ngô đến sản lượng hydro, chủng nghiên cứu được nuôi cấy trong môi trường PY sử dụng cơ chất bột ngô thô và bột
ngô đã qua tiền xử lý với nồng độ 10g/l. Đo OD và hàm lượng khí hydro sinh ra tại 0 đến 60 giờ ni cấy. Mỗi lần đo cách nhau 6 tiếng. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.7. Nghiên cứu khả năng sinh khí hydro trong điều kiện nuôi cấy kết hợp chủng Clostridium sp. với một chủng vi khuẩn khác chủng Clostridium sp. với một chủng vi khuẩn khác
Trong thí nghiệm của mình chúng tơi thử nghiệm nuôi cấy kết hợp một chủng Clostridium sp. được lựa chọn với một chủng vi sinh vật khác trong môi trường PY, nguồn cơ chất glucose 10g/l, 150 rpm, pH =7,0, T=350C để xem xét khả năng sinh trưởng và sinh khí hydro. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.8. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Excel, kết quả nghiên cứu là giá trị trung bình giữa 3 lần thí nghiệm và sai số được tính tốn.
CHƯƠNG III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn Clostridium sp. ưa ấm lên men kị khí có khả năng sinh hydro từ các mẫu phân động vật năng sinh hydro từ các mẫu phân động vật
Quá trình lên men sinh hydro có thể được thực hiện bởi các đơn chủng hoặc các tập đoàn vi khuẩn. Sản xuất hydro nhờ các tập đoàn vi khuẩn có ưu điểm là nguồn vật liệu dùng cho lên men rất đa dạng và không cần phải khử trùng nguồn vật