Chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian, nguồn cơ chất, nồng độ cơ chất, nguồn nitơ, pH, nhiệt độ… lên sự phát triển và sinh hydro của chủng
2.5.1. Đánh giá khả năng sinh trưởng và sinh hydro của các chủng đã phân lập
Sau khi phân lập được các chủng có khả năng sinh khí, tiến hành ni trong bình serum và đánh giá khả năng sinh hydro của các chủng. Tiến hành sàng lọc lựa chọn ra chủng có khả năng sinh nhiều khí nhất để tối ưu hóa điều kiện tạo khí.
2.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng và sinh khí
Chủng vi khuẩn được ni trong bình serum chứa mơi trường PY. Tiến hành nghiên cứu khảo sát tại các thời điểm: 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72 giờ tại pH 7,0, T= 350C, tốc độ lắc 150rpm.
2.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cơ chất đến khả năng sinh trưởng và sinh khí
Tiến hành khảo sát trên 6 nguồn cacbon sau (10g/l): saccharose, mantose, glucose, cellulose, xylose, lactose. Các nguồn cơ chất này được cho vào môi trường PY, tiến hành nuôi cấy tại pH = 7,0. T= 350C, tốc độ lắc= 150rpm. Tiến hành đo OD và lượng hydro sinh ra sau 48 giờ nuôi cấy.
2.5.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến khả năng sinh trưởng và sinh khí sinh khí
Chọn nguồn cơ chất thích hợp nhất từ thí nghiệm trên tiến hành khảo sát tại các nồng độ 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 (g/l). Tại pH = 7,0. T= 350C, tốc độc lắc 150rpm. Tiến hành đo OD và lượng hydro sinh ra sau 48 giờ nuôi cấy.
2.5.5. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng và sinh khí
Tiến hành khảo sát với một số nguồn nitơ sau (10g/l): các nguồn nitơ hữu cơ gồm pepton (P), cao men (Y), cao thịt (M) và các nguồn nitơ vô cơ gồm NH4Cl, NH4NO3. Chúng được bổ sung vào môi cơ bản (BM) PY: BM+P (môi trường cơ bản và pepton), BM+Y (môi trường cơ bản và cao men), BM + PY (môi trường cơ bản kết hợp cao men và pepton), BM + NH4Cl (môi trường cơ bản và NH4Cl), BM+ NH4NO3 (môi trường cơ bản và NH4NO3). Tiến hảnh nuôi cấy dưới điều kiện glucose 10g/l, pH = 7,0, T= 350C, tốc độ lắc 150rpm. Tiến hành đo OD và lượng hydro sinh ra sau 48 giờ nuôi cấy.
2.5.6. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng và sinh khí
Tiến hành khảo sát nghiên cứu tại các điều kiện pH: 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9; 9,5 trong bình serum với nguồn cơ chất glucose 10g/l, pH = 7,0, T= 350C, tốc độ lắc 150rpm. Tiến hành đo OD và lượng hydro sinh ra sau 48 giờ nuôi cấy.
2.5.7. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng và sinh khí
Tiến hành nghiên cứu khảo sát ở các nhiệt độ: 25, 30, 35, 37, 40, 45, 500C trong bình serum với nguồn cơ chất glucose 10g/l, pH = 7,0, T= 350C, tốc độ lắc 150rpm. Tiến hành đo OD và khí hydro sinh ra sau 48 giờ ni cấy.
2.5.8. Khảo sát ảnh hưởng của muối Natri dến khả năng sinh trưởng và sinh khí
Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của muối NaHCO3 lên sự sinh trưởng và sinh khí hydro của chủng nghiên cứu. NaHCO3 được bổ sung vào môi trường với các nồng độ sau: 240, 320, 400, 480, 560, 640 mg/l, pH = 7,0 (pH được điều chỉnh bằng NaOH 1% hoặc H2SO4 1%), T= 350C, tốc độ lắc 150rpm. Tiến hành đo OD và lượng khí hydro sinh ra sau 48 giờ ni cấy.
2.5.9. Khảo sát ảnh hưởng của muối Kali đến khả năng sinh trưởng và sinh khí
Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của muối K2HPO4 lên sự sinh trưởng và sinh khí của chủng nghiên cứu. K2HPO4 được bổ sung vào môi trường với các nồng độ sau: 24, 32, 40, 48, 56, 64 mg/l, pH = 7,0 (pH được điều chỉnh bằng NaOH 1% hoặc H2SO4 1%), T= 350C, tốc độ lắc 150rpm. Tiến hành đo OD và lượng khí hydro sinh ra sau 48 giờ nuôi cấy.
2.5.10. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng sinh trưởng và sinh khí
Tiến hành khảo sát ở các tốc độ lắc khác nhau 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 rpm với môi trường nuôi cấy PY, glucose 10g/l, pH = 7,0, T= 350C. Tiến hành đo OD và lượng khí hydro sinh ra sau 48 giờ ni cấy.
2.6. Thăm dò một số nguồn sản – phụ phẩm nơng nghiệp làm ngun liệu đầu vào cho q trình sản xuất hydro sinh học nhờ sự lên men của vi khuẩn kị khí ưa ấm Clostridium sp.
2.6.1. Nguồn cơ chất là bã đậu
Để xác định ảnh hưởng của cơ chất bã đậu đến sản lượng hydro, chủng nghiên cứu được nuôi cấy trong môi trường PY sử dụng cơ chất bã đậu thô và bã đậu đã qua tiền xử lý với nồng độ 10g/l. Đo OD và hàm lượng khí hydro sinh ra tại 0 đến 60 giờ nuôi cấy. Mỗi lần đo cách nhau 6 tiếng. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.6.2. Nguồn cơ chất là bột ngô
Để xác định ảnh hưởng của cơ chất bột ngô đến sản lượng hydro, chủng nghiên cứu được nuôi cấy trong môi trường PY sử dụng cơ chất bột ngô thô và bột
ngô đã qua tiền xử lý với nồng độ 10g/l. Đo OD và hàm lượng khí hydro sinh ra tại 0 đến 60 giờ nuôi cấy. Mỗi lần đo cách nhau 6 tiếng. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.7. Nghiên cứu khả năng sinh khí hydro trong điều kiện nuôi cấy kết hợp chủng Clostridium sp. với một chủng vi khuẩn khác chủng Clostridium sp. với một chủng vi khuẩn khác
Trong thí nghiệm của mình chúng tơi thử nghiệm nuôi cấy kết hợp một chủng Clostridium sp. được lựa chọn với một chủng vi sinh vật khác trong môi trường PY, nguồn cơ chất glucose 10g/l, 150 rpm, pH =7,0, T=350C để xem xét khả năng sinh trưởng và sinh khí hydro. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.8. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Excel, kết quả nghiên cứu là giá trị trung bình giữa 3 lần thí nghiệm và sai số được tính tốn.
CHƯƠNG III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn Clostridium sp. ưa ấm lên men kị khí có khả năng sinh hydro từ các mẫu phân động vật năng sinh hydro từ các mẫu phân động vật
Quá trình lên men sinh hydro có thể được thực hiện bởi các đơn chủng hoặc các tập đoàn vi khuẩn. Sản xuất hydro nhờ các tập đồn vi khuẩn có ưu điểm là nguồn vật liệu dùng cho lên men rất đa dạng và không cần phải khử trùng nguồn vật liệu đầu vào. Tuy nhiên nhược điểm của quá trình này là sản phẩm khí tạo thành khơng chỉ chứa hydro mà cịn chứa cả các khí khác. Vì vậy việc thu hồi và làm sạch khí hydro gặp nhiều khó khăn. Ngồi ra hydro tạo thành có thể bị các vi khuẩn sử dụng hydro tiêu thụ. Hơn nữa việc tối ưu hóa q trình sản xuất hydro cũng khó khăn hơn bởi tập đồn vi khuẩn chứa nhiều loại vi khuẩn có đặc tính sinh lý khác nhau. Vì vậy sản xuất hydro bằng đơn chủng thường được ứng dụng nhiều hơn ở quy mơ cơng nghiệp. Vì thế chúng tơi tiến hành phân lập các đơn chủng vi khuẩn có khả năng sinh hydro để từ đó lựa chọn những chủng có khả năng sinh hydro cao nhằm hướng tới ứng dụng chúng trong sản xuất ở quy mô công nghiệp.
Sau 48 giờ ni cấy, trong bình serum xuất hiện các đặc điểm sau:
- Khi nhẹ nhàng nhấc bình ra khỏi bể ni cấy lắc ổn nhiệt, phần đáy bình có những bọt khí nhỏ chứng tỏ có khí sinh ra.
- Phần nắp cao su ban đầu khi mới thực hiện ni cấy thì phẳng, nhưng sau 48 giờ nuôi cấy quan sát thấy nắp cao su cứng và phồng lên chứng tỏ có khí sinh ra.
- Nhìn vào dung dịch ni cấy cho thấy đục và có những mảnh trơi nổi trong dung dịch chứng tỏ đã có sự phát triển của vi khuẩn một cách mạnh mẽ.
- Dựa vào kết quả đo lượng khí hydro bằng máy GC xác định % khí hydro sinh ra của chủng sinh khí.
Kết quả: Trong 10 mẫu được phân lập gồm 4 mẫu phân trâu (CT1, CT2,
CT3, CT4), 5 mẫu phân bò (CB5, CB6, CB7, CB8, CB9), 1 mẫu phân voi (CV10) đều cho thấy có sự sinh khí hydro trong lần làm giàu thứ 3 với kết quả như sau:
Bảng 3.1: Sản lượng khí hydro trong các mẫu làm giàu lần 3
Mẫu phân lập Lượng khí hydro tạo
thành (ml/L mơi trường) CT1 170,23 ± 5,69 CT2 73,59± 3,28 CT3 41,23 ± 2,14 CT4 32,67± 4,11 CB5 301,08 ± 9,96 CB6 286,78± 14,37 CB7 35,46± 6,21 CB8 90,35± 1,24 CB9 195,89 ± 3,25 CV10 49,52± 2,98
Trong các mẫu sinh khí hydro chúng tôi lựa chọn những mẫu có khả năng sinh khí cao ≥ 100ml/L mơi trường gồm các mẫu: CT1, CB5, CB6, CB9 tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn Clostridium sp. kị khí, ưa ấm có khả năng sinh khí
hydro.
3.1.1. Đặc điểm hình thái tế bào
Từ 4 mẫu được phân lập trên các đĩa Peptri trong box kị khí chúng tơi nhận thấy chúng xuất hiện những khuẩn lạc giống nhau và khác nhau. Dựa vào đặc điểm về hình dạng, kích thước, màu sắc, bề mặt, mép, độ lồi, chúng tôi chọn các khuẩn lạc khác nhau ở các mẫu phân đem cấy riêng rẽ với ký hiệu lần lượt là CB1, CB2, CB3, CT4, CT5.
Sau khi tiêu bản vi khuẩn được nhuộm Gram và được quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 100 lần, chúng tơi nhận thấy 4 chủng vi khuẩn có đặc điểm của chi Clostridium: bắt màu tím khi nhuộm Gram chứng tỏ chúng là vi khuẩn
Hình 3.1: Hình thái t
Theo các báo cáo đ khuẩn hình que [56, 64 chủng vi khuẩn tạo khí m Ngồi ra có chủng CB1 hồng safranin khi nhuộm G
sinh hydro bao gồm cả vi khuẩn Gram âm v Gram dương là chủ yếu [10
chúng tơi. Chủng này ti
Hình
nh thái tế bào của các chủng CB2, CB3, CT4, CT5
Theo các báo cáo đã cơng bố, các vi khuẩn sinh khí hydro hầu hết l ình que [56, 64]. Vì vậy, kết quả quan sát được của chúng tôi cho thấy ủng vi khuẩn tạo khí mà chúng tơi phân lập được cũng có đặc tính
ủng CB1 khi nhuộm cho ra kết quả là vi khuẩn Gram âm, b ồng safranin khi nhuộm Gram. Nhiều cơng trình nghiên cứu đ
ồm cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương. Trong đó v ủ yếu [10]. Điều này cũng tương tự với kết quả nghi
ày tiếp tục được định danh sử dụng cho các nghi
Hình 3.2: Hình thái tế bào chủng CB1
CB2 CB3
CT4 CT5
CB1
, CB3, CT4, CT5
ố, các vi khuẩn sinh khí hydro hầu hết là các vi ợc của chúng tôi cho thấy các ợc cũng có đặc tính chung đó. ẩn Gram âm, bắt màu ứu đã công bố các chủng à Gram dương. Trong đó vi khuẩn ự với kết quả nghiên cứu của ợc định danh sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2. Định danh dựa vào khóa phân loại Bergey
Sau khi phân lập được các chủng khác nhau, dựa vào đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, 5 chủng sẽ được đánh giá dựa vào Khóa phân loại Bergey để tuyển chọn những chủng có khả năng sinh hydro.
Bảng 3.2: Tính chất sinh lý hóa sinh của các chủng đã phân lập từ phân gia súc Ký hiệu Ký hiệu chủng CB1 CB2 CB3 CT4 CT5 Gram - + + + + Di động + - + + - Catalase + - - - - Urease - - - - - Indole - + - + + Gelatinese - + + + + Lectin + - - + + Citrate + - - - - Oxidase - - - - - MR - + VP + - Khả năng sinh bào tử - + + + +
Dựa vào khóa định loại Berey các chủng CB2, CB3, CT4, CT5 có các đặc điểm đặc trưng thuộc chi Clostridium như: Gram dương, catalase âm tính, có khả
năng sinh bào tử…[80].
3.1.3. Định danh lồi bằng phân tích 16S rDNA
Sau khi tách chiết DNA genome và tinh sạch, DNA của các chủng vi khuẩn được dùng làm khuôn để nhân bản đoạn gen mã hóa 16S rRNA nhờ sử dụng cặp mồi đặc hiệu 27F và 1527R [46]. Sau khi kiểm tra kết quả PCR (Hình 3.3), sản
phẩm PCR sau khi tinh sạch sẽ đ ribosome.
Kết quả điện di genome v kĩ thuật PCR, các mẫu kí hiệu v khơng bị nhiễu và khơng có băng ph phù hợp với kích thước của đoạn gen m
Hình 3.3: Kết quả điện
M: Marker (100pb
Kết quả BLAST các chủng đ
phản ánh tính chính xác của việc định danh s Kết quả giải trình t
tương đồng trên Genbank cho th đoạn 16S rDNA của chủng
được định danh là Enterobacter cloacae
đồng 98% so với đoạn 16S r được định danh là Clostridium tương đồng 100% so v
đó chủng này được định danh đồng 100% so với đoạn 1
M (-)
ẩm PCR sau khi tinh sạch sẽ được gửi đi để giải trình t
ết quả điện di genome và sản phẩm nhân bản gen mã hóa 16s rRNA b ĩ thuật PCR, các mẫu kí hiệu và đánh số thứ tự như trong h
ơng có băng phụ, kích thước điện di sản phẩm khoảng 1500bp, ớc của đoạn gen mã hóa 16S rARN của vi khuẩn.
ết quả điện di sản phẩm nhân bản gen 16S rDNA b PCR
(100pb-1kb); (-): Đối chứng âm; (+): Đối chứng d
ết quả BLAST các chủng được hiển thị trong Bảng 3.3. Kết quả n ản ánh tính chính xác của việc định danh sơ bộ theo khóa phân loại Bergey.
ình tự khi so sánh với các trình tự gen 16S rD ên Genbank cho thấy: Chủng CB1 có tỉ lệ tương đ
ủa chủng Enterobacter cloacae MCE64A9 trên ngân hàng gen và
Enterobacter cloacae CB1. Chủng vi khuẩn CB2 có độ t ới đoạn 16S rDNA của chủng Clostridium sp. JC2
Clostridium sp.CB2, chưa đủ cơ sở định danh đến lo
so với đoạn 16S rDNA của chủng Clostridium beijerinckii ợc định danh là Clostridium beijerinckii CB3. Chủng
ới đoạn 16S rDNA của chủng Clostridium bifermentans
) (+) CB1 CB2 CB3 CT4 CT5 ình tự gen mã hóa 16S ã hóa 16s rRNA bằng ư trong hình có băng rõ nét, ản phẩm khoảng 1500bp, ủa vi khuẩn. NA bằng kĩ thuật
ối chứng âm; (+): Đối chứng dương.
ợc hiển thị trong Bảng 3.3. Kết quả này đã ộ theo khóa phân loại Bergey.
ự gen 16S rDNA của các loài ương đồng 99% so với ên ngân hàng gen và ủng vi khuẩn CB2 có độ tương JC272, do đó chủng này ở định danh đến lồi. Chủng CB3 Clostridium beijerinckii PS3, do ủng CT4 có hệ tương Clostridium bifermentans DPH – 1 1500bp
và được định danh là Clostridium bifermentans CT4. Chủng CT5 có hệ số tương đồng 99% với đoạn 16S rDNA của chủng Clostridium bifermentans ATCC 638 và được định danh là Clostridium bifermentans CT5.
Bảng 3.3: Kết quả định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử Ký hiệu Ký hiệu
chủng Tên chủng trên ngân hàng Gen
Tỉ lệ tương đồng (%)
CB1 Enterobacter cloacae MCE64A9 99%
CB2 Clostridium sp. JC272 98%
CB3 Clostridium beijerinckii PS3 100%
CT4 Clostridium bifermentans DPH-1 100%
CT5 Clostridium bifermentans ATCC 638 99%
Chủng CB1: kết quả phân tích trình tự 16S rDNA và kết quả thử nghiệm dựa vào khóa phân loại Bergey cho thấy chủng CB1 thuộc loài Enterobacter cloacae.
Đây là chi được biết đến là nhóm trực khuẩn hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện, Gram âm có khả năng sử dụng nguồn glucose lên men sinh hydro [58]. Phản ứng citrate và catalase dương tính, có khả năng di động là điểm tương đồng với Enterobacter cloacae [58]. Chủng vi khuẩn này đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu trước đó
như nghiên cứu của Harun Irrina và cộng sự (2012) [31].
Chủng CB2: dựa theo kết quả phân tích trình tự rDNA 16s và kết quả thử nghiệm dựa vào khóa phân loại Bergey cho thấy chủng CB2 thuộc chi Clostridium. Là vi khuẩn Gram dương, hình que, catalase âm tính, có khả năng hình thành bào tử là những đặc điểm điển hình của chi Clostridium. Chủng này có phản ứng citrate âm tính là đặc điểm của hầu hết các loài thuộc chi này [80]. Chủng khơng có khả năng di động tương đồng với một số loài trong chi. Cùng với kết quả phân tích trình tự rDNA 16s chúng tôi kết luận chủng thuộc chi Clostridium, chưa đủ dữ liệu để định danh đến loài.