Chương 1 TỔNG QUAN
1.3. Chanh dây
1.3.2. Thành phần của dịch ép quả chanh dây
Trong chanh dây bao gồm các thành phần mang đặc tính sinh học cao. Các thành phần trong các chiết xuất khác nhau: các hợp chất flavonoid, akaloid, các hợp chất cyanogenic, glycoside, vitamin, khoáng chất và các hợp chất terpenoid [24]. Trong các loại hợp chất, các hợp chất chiết xuất phenolic được biết đến với hoạt tính chống oxi hố và các tổn thương từ q trình tress oxi hố; do đó có thể ngăn ngừa các tình trạng viêm nhiễm, lão hố và các bệnh thoái hoá thần kinh. Các hợp chất phenolic tồn tại nhiều trong các loại thực vật, trong đó có cả chanh dây; các hợp chất phenolic chủ yếu thuộc nhóm C-glucoside flavones-chất có khả năng ngăn chặn q trình oxi hố của gốc tự do [30]. Chất C-glucoside flavones cũng được tìm thấy là loại flavonoid chính trong chiết xuất dịch ép từ thịt quả chanh dây. Trên thực tế, tổng hàm lượng flavonoid trong thịt quả chanh dây được báo cáo là khá đáng kể so với các đồ uống khác là nguồn cung cấp flovonoid như: nước cam và nước mía. Ngồi ra còn chứa các loại chất khác như: flavoid schafoside, isochafoside, isoorientin, orientin, isovitexin, luteolin-6-C-chinovoside và luteolin-6-C-fucoside đã được xác nhận [31]. Dịch ép quả chanh dây còn mang các loại vitamin cần thiết như: B12, A, E, K nhưng hàm lượng cao hơn cả vẫn là vitamin C (ascorbic acid) [29].Vitamin C mang lại nhiều tác dụng hữu ích nên được chú ý rất nhiều. Việc bổ sung vitamin C giúp tăng sức đề kháng của cơ thể, kích thích hệ tiêu hố, hạn chế viêm nhiễm và tress oxi hoá đồng thời làm đẹp da, tránh bị nứt nẻ ở các vùng da ở đầu ngón tay; đặc biệt là rất tốt cho tinh hoàn khi đối mặt với kim loại nặng như chì [32].
1.3.3. Sơ lược về vitamin C (ascorbic acid)
L-Ascorbic acid là một chất hòa tan trong nước gồm sáu carbon được tổng hợp từ glucose qua một số chất trung gian [33]. Nguồn thực phẩm giàu vitamin C thường nằm trong các loại trái cây có họ cam, qt, có tính acid hoặc có trong nước ép của chúng như: cherry, cam, dứa, điều, ổi, xồi, chanh và có cả chanh dây. Nó cũng nằm trong các loại rau củ như: cà chua, ớt xanh và đỏ, súp lơ và rau chân vịt. Sự hấp thụ vitamin C khoảng 70 - 90% lượng thực phẩm ăn vào khi nằm trong khoảng 30 – 180 g. Tuy nhiên, khi lượng khoảng 1 g thì khả năng hấp thụ giảm 50% [34].
Vitamin C đóng ba vai trị trong quá trình trao đổi chất của con người: yếu tố enzyme, chất khử hoá học và chất chống oxi hoá. Cùng một lượng viatmin C, người cao tuổi có mức lưu hành thấp hơn so với trẻ tuổi; có thể do sự hấp thụ của vitamin C từ ruột hoặc do sự suy giảm tái hấp thu từ thận. Liều lượng vitamin C được khuyến nghị nên tăng từ 90 mg (đối với nam) và 70 mg (đối với nữ) đến 120 mg mỗi ngày. Một vài nghiên cứu sơ bộ chỉ ra rằng với liều lượng cao hơn có thể ngăn chặn quá trình oxi hố lipoprotein tỉ trọng thấp, có thể cải thiện q trình chữ lành vết thương [23]. Vitamin C có khả năng hạn chế gốc tự do; tạo phức với các ion kim loại do sự xuất hiện của nhóm OH trên bề mặt liền kề của các nguyên tử carbon. Vitamin C được xem là chất bắt các gốc tự do và dập tắt các gốc tự do của O-2. Vitamin C hoạt động như một chất tìm kiếm gốc tự do thông qua ROS (Reactive Oxygen Species – các gốc oxi hoá hoạt động) bằng quá trình cho hoặc chuyển điện tử. Vitamin C chuyển đổi các gốc tự do thành các gốc khơng tự do vì các ngun tử hydro của ascorbic acid tạo hợp chất chứa các điện tử chưa ghép đôi của các gốc tự do và chuyển đổi chúng [13].
Vitamin C có tác dụng bảo vệ các enzyme chống oxi hoá của cơ thể như: glutathione, peroxidase, catalase và superoxide dimutase. Nó có đặc tính bảo vệ khỏi các độc tính chì trong hệ thống gan, hệ thống trung ương thần kinh và hệ thống sinh sản. Vitamin C giúp giảm stress oxi hố từ chì, hơn nữa nó cịn hiệu quả trong việc giảm lượng chì tích tụ - đây là điều quan trọng cần được chú ý nhiều và nâng
cao hoạt động của ALAD (delta-aminolevulinic acid dehydratase) trong máu. Vitamin C cũng được tìm thấy trong điều trị và ngăn ngừa bệnh tiểu đường, bệnh đục thủy tinh thể, đột quỵ, lão hoá và viêm [35]. Vitamin C cịn đóng vai trị rất quan trọng trong hệ sinh sản. Nó làm kích thích tăng hormone; cũng có thể ngăn chặn các giao tử bị tổn thương bởi các gốc tự do trong quá trình sinh sản và thụ tinh; cũng như kháng lại độc tính của các kim loại nặng. Vitamin C có các chức năng trong tiết hormone, bảo vệ giao tử và sửa chữa các mơ tuyến sinh dục. Do đó, các tác động của nó có thể được giải thích bằng các cơ chế tế bào và sinh hố tương tự cơ chế áp dụng trong mơ. Sự thiếu hụt vitamin C gây ảnh hưởng trực tiếp đối với khả năng sinh sản của nam giới; vitamin C cịn đóng vai trị trong sự tồn vẹn của hệ thống ống sinh dục và chức năng của tinh trùng. Vitamin C là cần thiết cho sự tiết và duy trì các lớp collagene của hệ thống ống sinh dục. Ở cấp độ nội tiết, vitamin C giúp tiết oxytocin-một loại peptide bởi tế bào Leydig. Mức vitamin C thấp hoặc thiếu hụt có liên quan đến số lượng tinh trùng thấp, tăng số lượng tinh trùng dị tật, giảm vận động và bị ngưng kết. Tác dụng có lợi của vitamin C đối với tinh trùng là nhờ vào kết quả của sự phá hủy các gốc tự do, nếu khơng thì sẽ ảnh hưởng đến cấu trúc DNA [33]. Đề xuất cho rằng quần thể tinh trùng khiếm khuyết về mặt di truyền có thể dẫn đến đột biến di truyền, dị tật bẩm sinh di truyền và ung thư; đặc biệt là ở những quần thể có nguy cơ bị tổn thương bởi oxi hoá cao như những người hút thuốc lá [36]. Nhờ vào khả năng làm giảm chì và kháng viêm cũng như giúp chữa lành tổn thương nên vitamin C rất hữu ích trong việc bảo vệ tinh hoàn khỏi các tổn thương do chì tác động.
1.4. TÌNH HÌNH CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THỀ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM Ở VIỆT NAM
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Năm 2006, [37] đã nghiên cứu tác dụng của việc bổ sung ascorbic acid và thiamine ở các nồng độ khác nhau đối với độc tính của chì gây ra ở tinh hồn chuột. Nghiên cứu được tiến hành với 75 con chuột được chia ngẫu nhiên thành 5 nhóm (15 con/nhóm): đối chứng; nhóm được xứ lí bằng chì kết hợp vitamin C (liều thấp,
trung bình và cao) và các nhóm cho uống vitamin C (nồng độ 140, 420, 1260 mg/kg) kết hợp với thiamine (10, 30, 90 mg/kg); Các nhóm được cho uống bằng đường miệng hằng ngày. Nhóm được xử lí với chì với nồng độ 0,2% chì acetate pha trong nước uống. Kết quả cho thấy, so với nhóm đối chứng, các biểu hiện TGFβ1 và caspase-3, chỉ số apoptotic (AI) và tổn thương DNA đều tăng đáng kể ở nhóm tiếp xúc với chì (P < 0,05). Sau khi can thiệp vitamin C liều thấp và liều trung bình, tỉ lệ tổn thương DNA và số lượng tế bào apoptotic ở chuột viêm tinh hoàn biểu hiện thấp hơn so với nhóm tiếp xúc với chì (P < 0,05) và các mơ bị tổn thương có sự cải thiện. Tuy nhiên, việc bổ sung đồng thời axit ascorbic và thiamine ở liều cao nhất đã thúc đẩy quá trình apoptosis tế bào tinh hồn thơng qua việc tăng biểu hiện TGFβ1 và caspase-3. Như vậy, khi điều trị kết hợp với thiamine và acid ascorbic ở liều thấp hơn đã ức chế hiệu quả các tế bào tinh hoàn khỏi quá trình apoptosis bởi chì acetate, nhưng liều cao hơn có thể làm tổn thương tinh hoàn trầm trọng hơn.
Năm 2009, [38] đã tiến hành nghiên cứu nhằm khảo sát tác dụng bảo vệ cùa ascorbic acid kết hợp thiamine đối với các tổn thương do chì gây ra ra ở tinh hồn chuột. Thí nghiệm được tiến hành với 45 chuột đực được ngẫu nhiên chia làm 3 nghiệm thức cho uống có kiểm sốt: đối chứng, Pb (chì acetate), Pb+vitamin C (420 mg/kg kết hợp 30 mg/kg, tương ứng); thực hiện trong 6 tuần. Kết quả cho thấy, nhóm chuột uống Pb làm cho số lượng và khả năng di động của tinh trùng từ mào tinh giảm so với đối chứng; trong khi nhóm uống Pb+vitamin làm tăng đáng kể về số lượng và độ di động tinh trùng chuột, đồng thời ức chế quá trình apoptosis do chì gây ra.
Năm 2012, [39] khảo sát vai trị kháng độc tính chì của vitamin C và vitamin E lên hệ sinh sản chuột cống đực (albino rat). Nhóm này sử dụng chì từ chì acetate (60 mg/kg thể trọng) và vitamin C (40 mg/kg thể trọng). Sau 6 tuần thí nghiệm, kết quả cho thấy vitamin C giúp cải thiện độc tính của chì thơng qua một chỉ số hormone sinh dục đực và cấu trúc mơ tinh hồn chuột. Cụ thể, chì làm giảm độ di động và số lượng tinh trùng cách biệt so với nhóm đối chứng (28,20% so với 46,40%; 36,00x106/ml so với 53,75x106/ml, tương ứng), làm tăng hình dạng bất
thường của tinh trùng chuột (21% so với 6,00%, tương ứng). Nhưng vitamin C đã cải thiện được kết quả này với độ di động, số lượng và hình dạng bất thường tương ứng là 35,20%; 42,25x106/ml và 8,80%.
Năm 2017, [40] đã nghiên cứu tác dụng của ascorbic acid (AA) đối với chức năng sinh sản ở chuột đực tiếp xúc với chì acetate. Tổng cộng có 50 con chuột đực được chia thành 5 nhóm bằng nhau; nhóm đối chứng (chỉ uống nước máy), nhóm Pb (uống 0,2% acetate chì/kg thể trọng) và ba nhóm cịn lại (nhận 500, 1000 và 1500 mg/kg thể trọng AA cùng với 0,2% acetate chì/kg thể trọng), tương ứng. Các liều (dưới dạng dung dịch) được dùng bằng đường uống mỗi ngày trong 8 tuần. Các tinh trùng bất thường và chết đã được đánh giá. Các kích thích tố testosterone, luteinizing (LH) và kích thích nang trứng (FSH) được đo. Hoạt tính chống oxi hố [glutathione, axid thiobarbituric), tổng khả năng chống oxi hoá (TAC) và mức oxit nitric (NO)] đã được xác định. Kiểm tra mô bệnh học đã được thực hiện cho các ổ viêm ở tinh hoàn. Kết quả cho thấy Pb gây ra sự gia tăng đáng kể về tỉ lệ tinh trùng chết và bất thường ở nhóm Pb (43,0%; 67,2%) so với nhóm chứng (6,0%; 18,6%). Trong khi đó, AA làm cải thiện đáng kể về độ di động, tỉ lệ sống và số lượng tinh trùng bất thường bởi độc tính của Pb. Ngồi ra, Pb gây ra sự gia tăng đáng kể FSH (1,99 mIU/L) và LH (1,2 mIU/L) và giảm nội tiết tố testosterone (0,86 nmol/L) so với nhóm đối chứng (0,64 mIU/L, 1,2 mIU/L, 5,24 nmol/L) tương ứng. Trong khi đó, AA (1500 mg/kg BW) giúp tăng hàm lượng hormone testosterone. Đối với khả năng chống oxi hoá, Pb gây ra sự gia tăng đáng kể mức NO và TBARS so với nhóm đối chứng, trong khi nó làm giảm đáng kể mức GSH và TAC. Còn AA (1500 mg/kg BW) đã làm giảm độc tính của Pb thơng qua các chỉ số này. Đặc biệt, AA đã làm giảm tác hại của acetate chì đối với mơ tinh hồn chuột.
Năm 2017, [41] khảo sát vai trò của vitamin C lên cấu trúc giải phẫu và một số chỉ tiêu sinh hố của độc tính Pb và Cadmium. Sử dụng chì từ chì acetate (20 mg/kg/thể trọng) và vitamin C (30 mg/kg thể trọng) trên chuột cống (albino rat). Sau 30 ngày thí nghiệm, kết quả cho thấy. Vitamin C (30 mg/kg thể trọng) giúp cải
thiện đáng kể khối lượng cơ thể chuột, các chỉ số huyết học và chỉ số sinh hố bị tác động bởi độc tính của chì.
Năm 2018, [42] khảo sát vai trị của vitamin C kháng lại độc tính của chì trên đối tượng chuột cống đực (albino rat). Nhóm này dùng vitamin C (27 mg/kg thể trọng và chì từ chì acetate (10,8 mg/kg thể trọng) trong 28 ngày qua đường uống. Kết quả cho thấy, vitamin C có giúp cải thiện độc tính của chì thơng qua cấu trúc mơ học của gan và lách chuột. Tuy nhiên, nghiên cứu này chưa khảo sát trên hệ sinh sản chuột đực.
Như vậy, qua các cơng trình trên cho thấy, vitamin C có tiềm năng rõ rệt trong việc kháng độc tính của chì. Tuy nhiên, các nghiên cứu này đều sử dụng vitamin C thương mại. Với mong muốn sử dụng vitamin C từ nguồn tự nhiên, nên đề tài này hướng tới việc chọn vitamin C từ quả canh dây để thực hiện khảo sát.
1.4.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Cho đến hiện nay, ở Việt Nam vẫn chưa có nhiều cơng trình khoa học nghiên cứu về khả năng kháng độc tính chì của vitamin C (ascorbic acid) cũng như dịch ép quả chanh dây trên tinh hoàn chuột. Các nghiên cứu hầu như khảo sát về khả năng kháng khuẩn của vitamin C ở hải sản và nguồn vitamin C cũng khơng phải có trong quả chanh dây.
1.4.3. Nhận định chung về tình hình nghiên cứu
Hiện tại, trong nước vẫn chưa có nhiều nghiên cứu rõ ràng về khả năng kháng độc tính chì của dịch ép quả chanh dây (với vitamin C lại là thành phần chiếm khối lượng đáng kể) lên hệ sinh sản chuột nhắt trắng đực trong thời gian dài (hơn 30 ngày). Vì lẽ đó, việc thực hiện đề tài này góp phần cung cấp dẫn liệu khoa học để có thể làm cơ sở cho các bước nghiên cứu tiếp theo. Như vậy, chanh dây là một nguồn cung cấp vitamin C tự nhiên, thân thiện với mọi người và mơi trường; có thể thay thế cho các nguồn vitamin C thương mại. Từ đó, giới thiệu cơng dụng của loại quả này, đóng góp lợi ích to lớn cho y học.
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
2.1.1. Thời gian nghiên cứu
Khoá luận được tiến hành từ tháng 10/2021 đến tháng 4/2022.
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện tại Phịng thí nghiệm Giải phẫu – Sinh lí Người và Động vật (M103), Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh.
Mẫu mơ tinh hồn được nhuộm H&E tại Phòng giải phẫu bệnh – Tế bào học - Phòng khám Đa khoa Đại phước, Thành phố Hồ Chí Minh.
2.2. DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VÀ HỐ CHẤT
2.2.1. Dụng cụ, thiết bị dùng chăm sóc chuột và thu tinh trùng chuột
Bảng 2.1. Dụng cụ, thiết bị chăm sóc chuột
STT Tên dụng cụ, thiết bị Xuất xứ
1 Phòng ni động vật thí nghiệm Việt Nam
2 Chuồng ni chuột Việt Nam
3 Bình nhựa đựng nước uống cho chuột (75 ml) Việt Nam
4 Máy lạnh Nhật
5 Nhiệt kế điện tử đo nhiệt độ và độ ẩm Đức
6 Màn che Việt Nam
7 Đồ chơi cho chuột Việt Nam
Bảng 2.2. Dụng cụ, thiết bị lấy máu chuột và quan sát tiêu bản
STT Tên dụng cụ, thiết bị Hãng sản xuất Xuất xứ
1 Kính hiển vi soi nổi Nikon Nhật
2 Kính hiển vi quang học Olympus Nhật
3 Kính hiển vi đảo ngược Nikon Nhật
4 Cân phân tích Shimadzu Nhật
6 Ống trộn bạch cầu Heinz Herenz Hamburg Đức
7 Lame Greetmed Trung Quốc
9 Kim trích máu Vinahankook Việt Nam
10 Pipetman P200 ISOLAB Đức
11 Falcon 50 Kartel Spa Pháp
12 Kim tiêm 1mL Vinahankook Việt Nam
13 Típ vàng Việt Nam
14 Eppendorf 1,5 mL
15 Bộ đồ mổ Việt Nam
16 Buồng đếm Neubauer Heinz Herenz Hamburg Đức
17 Đĩa petri Φ 35 Steriplan Đan Mạch
2.2.2. Hố chất và dung dịch thí nghiệm
Bảng 2.3. Hố chất pha dung dịch thí nghiệm
STT Tên hố chất Hãng sản xuất Xuất xứ
1 Chì (II) nitrate Merck Đức
2 Eosin 0,5% Sigma Mỹ
3 Eosin 1% Sigma Mỹ
4 Nigrosin 10% Sigma Mỹ
5 Formaldehyde Xilong Scientific Trung Quốc
6 Kali dihydrogen phosphate Merck Đức 7 di-Natri hydrogen phosphate Merck Đức
8 Dung dịch CZB Tự pha
Dung dịch thí nghiệm bao gồm:
Vitamin C thương mại: Ceelin 60 ml của Cơng ty TNHH United International Pharma, thành phần chính Vitamin C (100 mg/5ml).
Dung dịch thuốc nhuộm Eosin-nigrosin dùng để nhuộm tinh trùng
Dung dịch pha loãng tinh trùng CBZ: NaCl (477,477 mg/100 mL) + KCl (35,984 mg/100 mL) + KH2PO4 (16,048 mg/100mL) + MgSO4 (14,16 mg/100 mL) + CaCl2 (18,87 mg/100 mL) + NaHCO3 (211,088 mg/100mL) + Sodium lactate (C3H5NaO3) (350,56 mg/100 mL) + Sodium piruvate (C3H3NaO3) (4,185 mg/100 mL) + L-Glutamine (C5H10N2O3) (14,6 mg/100 mL) + EDTA (C10H16N205) (2,684
mg/100 mL+ Bonine serum albumin (BSA) (300 mg/100 mL) + Gentamicine (1 mg/100 mL).
Dung dịch formaldehyde cố định mẫu: formaldehyde 10% + KH2PO4 (4 g/1000 ml) + Na2HPO4 (6,5 g/1000 ml).
Chanh dây tím đạt chuẩn VietGap (Hình 2.1) được mua tại siêu thị dùng để thu dịch ép thịt quả.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đề tài đề xuất thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ Hình 2.1
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng thể
Mỗi nghiệm thức bố trí 8 chuột
2.3.1. Phương pháp chăm sóc chuột
Chuột nhắt trắng đực (Mus musculus var. albino) 5 tuần tuổi được mua từ
Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh. Chuột được ni ổn định ở điều kiện phịng