Hình 2 .5 Cân trọng lượng chuột trước khi đưa vào các nghiệm thức
Hình 2.6 Phương pháp thu mào tinh và mẫu tinh hoàn
A. Mào tinh B. Tinh hồn
Hình 2.7. Phương pháp thu tinh dịch chuột trong mơi trường CZB
2.3.4.5. Phương pháp xác định khối lượng và kích thước tinh hồn
- Cân khối lượng từng tinh hồn của từng chuột thí nghiệm để tính khối lượng tinh hồn trung bình.
- Dùng thước kẹp đo kích thước từng tinh hồn của từng chuột thí nghiệm (Hình 2.8) để xác định kích thước trung bình của tinh hồn.
Hình 2.8. Phương pháp đo kích thước tinh hoàn chuột
2.3.4.6. Phương pháp đánh giá mật độ tinh trùng chuột
Mật độ tinh trùng (C) là số tinh trùng hiện diện xác xuất trong 1mL tinh dịch. Thực hiện việc đếm tinh trùng bằng phương pháp đếm tế bào trên buồng đếm tế bào cải tiến. Pha loãng tinh trùng đã được chuẩn bị ở mục 2.3.4.4 theo tỉ lệ 10 𝜇L tinh dịch với dung dịch pha loãng tinh trùng tương ứng, ta được lúc này mẫu tinh trùng được pha loãng 10 lần. Lấy 20 𝜇L mẫu tinh trùng vừa pha chuyển vào buồng đếm (Hình 2.9). Đếm số lượng tinh trùng trong 400 ơ nhỏ tương ứng 25 ơ lớn.
Cơng thức tính:
C = N x 104 x D
Trong đó:
+ C: Mật độ tinh trong trong tinh dịch + D: Độ pha lỗng tinh dịch
Hình 2.9. Mật độ tinh trùng trên buồng đếm Neubauer (x40)
2.3.4.7. Phương pháp đánh giá chất lượng tinh trùng chuột
Chất lượng tinh trùng chuột được đánh giá thông qua tỉ lệ sống, tỉ lệ tinh trùng bình thường (hình dạng, độ di động) [44].
- Tỉ lệ sống của tinh trùng được xác định bằng phương pháp nhuộm kép với thuốc nhuộm Eosin – Nigrosin. Tinh trùng sống khi đầu tinh trùng không bắt màu thuốc nhuộm, tinh trùng chết sẽ bắt màu hồng của thuốc nhuộm (Hình 2.10). Thực hiện đếm số tinh trùng chết trong tổng số 200 tinh trùng cho một chuột thí nghiệm (lặp lại 3 lần tương ứng với 600 tinh trùng/chuột), từ kết quả này tính được tỉ lệ tinh trùng sống.
- Độ di động của tinh trùng được xác định trực tiếp từ mẫu tinh dịch đã chuẩn bị ở mục 2.3.4.4 dưới kính hiển vi đảo ngược thơng qua phần mềm camera hỗ trợ. Tạo vi giọt tinh dịch (100 µl) dưới lớp dầu khống, quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược và quay video, đếm 100 tinh trùng di động các kiểu (tiến thẳng, bơi vòng, khơng bơi tiến thẳng) từ đó xác định số lượng tinh trùng di động bình thường (tiến thẳng) ở mỗi chuột (lặp lại 03 lần tương ứng với 300 tinh trùng/chuột). Từ kết quả này sẽ quy ra được tỉ lệ di động của tinh trùng.
- Tỉ lệ dị dạng của tinh trùng được khảo sát thông qua mẫu nhuộm kép (đánh giá tỉ lệ sống) và video đánh giá độ di động của tinh trùng chuột. Sau khi khảo sát, đề tài chọn phương pháp xác định tỉ lệ dị dạng thông qua video di động của tinh trùng chuột (độ chính xác cao hơn). Đếm số tinh trùng dị dạng về hình thái: cổ cong, đi ngắn, hai đi, hai đầu, có chấm đốm ở phần đi trong tổng số 100 tinh trùng và lặp lại 3 lần ở mỗi chuột (300 tinh trùng/chuột). Từ đó tính tỉ lệ tinh trùng bất thường.
Hình 2.10. Trạng thái của tinh trùng sau khi nhuộm kép (x40)
A. Trạng thái tinh trùng sống B. Trạng thái tinh trùng chết
2.3.4.8. Phương pháp đánh giá chất lượng và quan sát vi thể của tinh hoàn
Sau khi thu nhận tinh hồn ở các lơ bố trí thí nghiệm, cân trọng lượng sau đó bảo quản trong dung dịch formalin 10% (hình 2.11) và gửi mẫu để nhuộm H&E. Đánh giá mức độ tổn thương qua tiêu bản cố định dưới kính hiển vi quang học tại phịng thí nghiệm Giải phẫu – Sinh lí người và Động vật.
Hình 2.11. Hình minh hoạ mẫu ngâm tinh hồn chuột nhắt trắng
2.3.4.9. Phương pháp xử lí số liệu
Tất cả số liệu của đề tài được xử lí theo các thuật tốn xác suất thống kê trên máy vi tính bằng phần mềm Minitab 18. Phân tích phương sai một yếu tố (One – way Anova). Các số liệu trung bình được trình bày ở dạng 𝑋̅ ± 95 % CI. Mức ý nghĩa được sử dụng để kiểm định sai khác có ý nghĩa các nghiệm thức là 0,05. Phân tích phương sai hai yếu tố (Two – way Anova) về thời gian và nghiệm thức thí nghiệm. Dùng hàm Turkey để kiểm định các số liệu.
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. TÁC DỤNG KHÁNG ĐỘC TÍNH CHÌ CỦA DỊCH ÉP QUẢ CHANH DÂY LÊN ĐỘ TĂNG TRỌNG CỦA CHUỘT
Tổng cộng có 48 chuột được kiểm tra cân nặng trước khi được đưa vào bố trí thí nghiệm nhằm đảm bảo có sự tương động về khối lượng cơ thể. Cân nặng trung bình của chuột đưa vào thí nghiệm đạt 20,61±0,28 g (xem phụ lục mục 1.1). Kết quả bố trí chuột ngẫu nhiên vào các nghiệm thức có sự đồng đều về khối lượng (p = 0,262), (xem phụ lục mục 1.1). Vì thế, điều kiện ban đầu thí nghiệm của các chuột có sự tương đương về mặt cân nặng, điều này giúp cho sự đánh giá các kết quả thí nghiệm có độ tin cậy cao hơn.
3.1.1. Độ tăng trọng trung bình của chuột tại các nghiệm thức khảo sát sau mỗi 4 tuần thí nghiệm
Hình 3.1. Biểu đồ thể hiện độ tăng trọng trung bình của chuột sau mỗi 4 tuần ở các nghiệm thức
Từ phụ lục mục 1.2 và hình 3.1; ta có độ tăng trọng trung bình của các nghiệm thức khảo sát như sau:
Sau 4 tuần thí nghiệm, chuột ở các nghiệm thức Pb có độ tăng trọng thấp nhất (5,4 g) và khác biệt mang ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại (p < 0,01). Các nghiệm thức cịn lại, chuột ở từng nghiệm thức có độ tăng trọng tương đồng với nhau về mặt ý nghĩa thống kê (tăng giao động từ 10,11-12,43 g; p > 0,05) và độ tăng trọng tăng gần gấp đôi so với nhóm chuột ở nghiệm thức Pb (10,11- 12,43 so với 5,4 g; p < 0,01; tương ứng). Trong đó, nghiệm thức CD có độ tăng trọng cao nhất và tương đương với độ tăng trọng ở nghiệm thức đối chứng (12,43 so với 12,20 g; p > 0,5; tương ứng). Kết quả cho thấy, chì làm chậm tốc độ tăng trọng rõ rệt; dịch ép chanh dây, vitamin C thương phẩm thể hiện được vai trò hỗ trợ tăng trọng đối với chuột bình thường lẫn chuột nhiễm chì.
Sau 8 tuần, chuột ở tất cả nghiệm thức đều có tốc độ tăng trọng tăng dần và tương đồng với nhau về mặt ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Trong đó, nghiệm thức ĐC vẫn duy trì được độ tăng trọng cao nhất nhưng vẫn tương đương với các nghiệm thức có bổ sung dịch ép chanh dây hay nghiệm thức uống vitamin C (p > 0,05). Riêng ở nghiệm thức Pb, tốc độ tăng trọng của chuột gần như không khác biệt so với thời điểm 4 tuần thí nghiệm và có xu hướng bị giảm (5,30 g so với 5,45 g; p > 0,05; tương ứng) và giảm hẳn so với các nghiệm thức còn lại gần tới 2,6 - 3 lần (5,3 g so với 13,68 – 15,08 g; p < 0,01; tương ứng). Kết quả này cho thấy, chì vẫn tiếp tục làm giảm độ tăng trọng của chuột và làm cho khối lượng cơ thể chuột có xu hướng giảm xuống thấp hơn so với thời điểm 4 tuần thí nghiệm (25,60 g so với 26,35 g; p > 0,05; tương ứng). Dịch ép chanh dây vẫn duy trì được tốc độ tăng trọng của chuột ở mức ổn định tương ứng với nghiệm thức ĐC ở cả 2 nồng độ khảo sát, tuy nhiên, nồng độ chanh dây 20 mg/kg thể trọng có phần thể hiện hiệu quả tốt hơn so với nồng độ 30 mg/kg thể trọng (14,43 g so với 13,68 g; p > 0,05; tương ứng).
3.1.2. Sự tương quan giữa hai yếu tố nghiệm thức và thời gian nuôi ảnh hưởng lên độ tăng trọng trung bình của chuột
Khi xét về về sự tương quan giữa hai yếu tố nghiệm thức và thời gian nuôi ảnh hưởng lên độ tăng trọng của chuột (xem phụ lục mục 1.2):
Xét từng yếu tố riêng lẻ (nghiệm thức hoặc thời gian thí nghiệm), từng yếu tố đều ảnh hưởng đến độ tăng trọng của chuột (p < 0,01). Ở từng nghiệm thức, tốc độ tăng trọng tuân đều tăng theo thời gian từ tuần 4 đến tuần 8; riêng nghiệm thức chỉ xử lí chì thì độ tăng trọng giảm rõ rệt so với các nghiệm thức theo thời gian. Khi xét sự tương quan của cả 2 yếu tố (nghiệm thức và thời gian thí nghiệm) cho thấy cả 2 yếu tố này đều ảnh hưởng đến độ tăng trọng của chuột (p < 0,01).
Tóm lại, dịch ép chanh dây đã cho thấy được vai trị kích thích tốc độ tăng trọng của chuột và khả năng kháng độc chì trong việc duy trì tăng trọng của chuột sau 8 tuần thí nghiệm; hiệu quả này tương đương với hiệu quả của vitamin C thương mại cũng như điều kiện ni bình thường khơng bị nhiễm chì, trong đó nồng độ dịch ép chanh dây 20 mg/kg thể trọng thể hiện hiệu quả hơn sau 8 tuần thí nghiệm.
Bàn luận
Theo [45] cho thấy khối lượng cơ thể chuột bị giảm dưới tác động của chì acetate với nồng độ 1% sau 8 tuần; của [46] cho thấy khi chuột nhiễm chì acetate (150 mg/kg) có khối lượng cơ thể giảm đáng kể so với đối chứng khơng nhiễm chì (36,33 g so với 40,83 g, p < 0,5). Theo [47] khi cho chuột nhiễm chì acetate với nồng độ 100 mg/kg thể trọng trong vòng 4 tuần thu được khối lượng cơ thể chuột bị giảm đáng kể (140±2,9 g) so với đối chứng (175±5 g). Trong khi đó, chuột nhiễm chì được điều trị bằng Vitamin C (25 g/100 g Vitamin C) trong cùng khoảng thời gian thí nghiệm, kết quả cho thấy khối lượng cơ thể chuột cải thiện đáng kể (164±5 g). Kết quả tương tự ở [48], với chuột được xử lí với chì acetate (100 ppm được pha trong nước uống) làm khối lượng cơ thể giảm sau 4 tuần thí nghiệm; đồng thời việc bổ sung vitamin C (100 mg/kg) giúp cải thiện vấn đề này. Kết quả của [49] cho thấy khối lượng cơ thể chuột bị nhiễm chì acetate (10 mg/mL) thấp đáng kể so với chuột khơng bị nhiễm chì sau 28 ngày; cùng với nồng độ chì đó có sự bổ sung của vitamin C (200 mg/2 mL) có sự cải thiện khối lượng cơ thể chuột trong cùng khoảng thời gian. Như vậy, kết quả trong thí nghiệm của chúng tơi cho thấy có sự tương đồng với các kết quả đã được cơng bố: chì làm giảm khối lượng cơ thể chuột sau 4 - 8
tuần gây nhiễm; dịch ép chanh dây có hàm lượng vitamin C đã giúp cải thiện được tình trạng này tương đương với nghiệm thức đối chứng (khơng uống chì, không uống chanh dây).
Những kết quả trên cho thấy chì là tác nhân gây độc làm giảm đáng kể khối lượng cơ thể chuột theo thời gian nhiễm và tích trữ trong cơ thể, từ đó trực tiếp ảnh hưởng đến tốc độ tăng trọng. Việc bổ sung vitamin C giúp cơ thể tăng cường khả năng cải thiện tác hại của độc tính chì gây ra đối với khối lượng cơ thể chuột. Dịch ép chanh dây và vitamin C thương mại đều có hiệu quả theo thời gian thí nghiệm (sau 4 và 8 tuần thí nghiệm). Khối lượng cơ thể chuột giảm có thể là do khi bị nhiễm chì, chuột biếng ăn hơn so với bình thường từ đó làm cho độ tăng trọng giảm [50]; chì tác động đến cơ thể làm tiêu hao lượng đạm và các năng lượng cơ bản từ đó gây giảm độ tăng trọng [51]. Ngồi ra, độc tính chì gây gián đoạn trong q trình hấp thu và chuyển hoá các chất dinh dưỡng trong thức ăn cần thiết cho cơ thể, dẫn đến thiếu chất dinh dưỡng [52] cũng góp phần làm giảm khối lượng cơ thể.
Dịch ép chanh dây giúp cải thiện trọng lượng cơ thể nhờ vào khả năng của vitamin C (252 mg/kg) giúp cho cơ thể tránh bị thất thoát về chất đạm cũng như năng lượng trong cơ thể; cải thiện được các ảnh hưởng có hại của chì lên trọng lượng [48]. Vitamin C có lợi ích trong việc kháng viêm nên có thể bảo vệ cơ thể khỏi các tổn hại của chì cũng như hạn chế hấp thụ chì ở ruột [53]; hạn chế rối loạn, tăng cường hấp thu và chuyển hoá các chất dinh dưỡng. Có lợi trong việc đào thải chì khỏi cơ thể sớm ở giai đoạn phơi nhiễm [54]; có thể hạn chế ảnh hưởng của các phản ứng oxi hoá và các gốc tự do.
Tóm lại, dịch ép chanh dây đã thể hiện được khả năng kháng độc tính chì giúp cải thiện độ tăng trọng của chuột với cả 2 nồng độ sau 8 tuần thí nghiệm, trong đó nồng độ 20 mg/kg thể trọng thể hiện hiệu quả vượt trội hơn so với nồng độ 30 mg/kg.
3.2. TÁC DỤNG KHÁNG ĐỘC TÍNH CHÌ CỦA DỊCH ÉP QUẢ CHANH DÂY LÊN KHỐI LƯỢNG TINH HOÀN CHUỘT
3.2.1. Khối lượng trung bình của tinh hồn chuột tại các nghiệm thức khảo sát qua mỗi 4 tuần thí nghiệm
Hình 3.2. Biểu đồ thể hiện khối lượng trung bình tinh hoàn chuột sau mỗi 4 ở các nghiệm thức
Sau 4 tuần thí nghiệm, khối lượng tinh hồn chuột ở nghiệm thức Pb cao hơn so với các nghiệm thức còn lại từ từ 1,33 - 1,5 lần (p < 0,05). Trong khi đó, khối lượng tinh hồn chuột của các nghiệm thức cịn lại có sự tương đồng với nhau và dao động từ 0,08 - 0,09 g (p > 0,05). Kết quả cho thấy, chì đã có ảnh hưởng đến khối lượng tinh hoàn chuột, làm cho khối lượng tinh hoàn chuột tăng; dịch ép chanh dây đã thể hiện được vai trị duy trì khối lượng tinh hồn ở mức bình thường và khả năng kháng độc chì lên khối lượng tinh hồn ở cả 2 nồng độ khảo sát.
Sau 8 tuần thí nghiệm, khối lượng tinh hoàn chuột ở các nghiệm thức có sự biến động khác nhau. Các nghiệm thức có uống dịch ép chanh dây đều có xu hướng làm tăng khối lượng tinh hoàn chuột so với thời điểm 4 tuần: nghiệm thức VC, PbCD1, PbCD2 đều tăng hẳn (0,11 g so với 0,08 g; 0,09 g so với 0,08 g; 0,01 so với 0,08 g; p < 0,05; tương ứng). Trong khi đó, ĐC khối lượng tinh hồn chuột có xu hướng giảm so với thời điểm 4 tuần thí nghiệm, nhưng chưa tạo được sự cách biệt về mặt thống kê (p > 0,05). Riêng ở nghiệm thức Pb, khối lượng tinh hồn chuột giảm nhưng khơng nhiều và vẫn cao hơn các nghiệm thức còn lại (p < 0,05), nhưng chưa có sự khác biệt rõ rệt về mặt thống kê với nghiệm thức VC (p > 0,05). Kết quả
cho thấy, chì vẫn ảnh hưởng lên khối lượng tinh hồn chuột dù khối lượng tinh hoàn chỉ giảm nhẹ; dịch ép chanh dây thể hiện được vai trị bảo vệ tinh hồn chuột, tăng khối lượng tương đồng với nghiệm thức ĐC và với nghiệm thức khơng có tác động của chì. Kết quả cũng cho thấy cả 2 nồng độ dịch ép chanh dây (20 mg/kg và 30 mg/kg) thể hiện hiệu quả như nhau và tương đương với hiệu quả của vitamin C thương mại.
3.2.2. Sự tương quan giữa hai yếu tố nghiệm thức và thời gian nuôi ảnh hưởng lên khối lượng tinh hoàn chuột
Khi xét về sự tương quan giữa hai yếu tố nghiệm thức và thời gian nuôi (xem phụ lục 2), cho thấy: xét từng yếu tố đơn lẻ, chỉ có yếu tố nghiệm thức có ảnh hưởng đến khối lượng tinh hoàn chuột (p < 0,01); yếu tố thời gian thì lại chưa ảnh hưởng đến khối lượng tinh hoàn chuột (p > 0,05). Khối lượng tinh hoàn chuột tại các nghiệm thức chỉ dao động và chênh lệch ở các nghiệm thức VC, PbCD1 và PbCD2; cịn lại khơng đáng kể từ tuần 4 đến tuần 8 (p > 0,05); riêng nghiệm thức chỉ uống chì (Pb) vẫn ln khác biệt với đối chứng qua mỗi 4 tuần (p < 0,05). Khi xét sự tương quan giữa hai yếu tố, cả 2 yếu tố đều cùng tác động gây ảnh hưởng lên khối lượng tinh hoàn chuột (p < 0,01).
Tóm lại, dịch ép chanh dây thể hiện được khả năng duy trì khối lượng tinh hồn ở mức ổn định sau 8 tuần thí nghiệm ở cả 2 nồng độ khảo sát dưới tác động của chì; hiệu quả của của 2 nồng độ khảo sát tương đương nhau.
Bàn luận
Theo [55] cũng cho thấy kết quả tương tự, họ quan sát thấy chuột nhiễm chì cấp tính (75 mg/kg) khi tiêm vào phúc mạc cũng làm tăng khối lượng tinh hoàn ở chuột trưởng thành liên tiếp trong 3 ngày. Theo [56] cho thấy chì actate (20 mg/kg) làm tăng khối lượng tinh hoàn chuột cao hơn đối chứng sau 5 ngày liên tiếp. Theo [46], chì acetate (150 mg/kg) cũng làm tăng mạnh khối lượng của tinh hoàn chuột. Nghiên cứu [57], cho kết quả tương tự với khối lượng tương đối của tinh hoàn tăng mạnh khi tiếp xúc với chì (20 mg/kg) trong vịng 7 ngày. Như vậy, kết quả của
chúng tơi có sự tương đồng với các cơng bố này là chì đã làm tăng khối lượng tinh hồn chuột.
Tuy nhiên, hiện nay có một số cơng trình cơng bố cho kết quả ngược lại: chì