- Hiệu suất chiết pectin đƣợc tính theo cơng thức [6]:
Trong đó: Wt: khối lƣợng pectin sau khi chiết (g)
Ws: khối lƣợng mẫu cỏ biển ban đầu (đã sấy khơ) (g)
2.2.2. Điều chế pectin có chỉ số ester hóa khác nhau
Khử ester hóa pectin đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp [3, 4, 5], cụ thể nhƣ sau: Chuẩn bị mẫu pectin với mức độ ester hóa dƣới 60,0% đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp khử kiềm của pectin ester hóa cao trong dung dịch nƣớc - ethanol. Ban đầu, pectin thơ có hàm lƣợng ester hóa cao đƣợc rửa với 50% dung dịch ethanol để tinh chế. Trong quá trình này 200g pectin đƣợc tạo dung dịch huyền phù trong 2L dung dịch ethanol trong 30 phút; sau đó pectin đƣợc tách bằng cách lọc, tráng trong phễu lọc lần lƣợt với 1,5L dung dịch ethanol 50% và 1L dung dịch ethanol 95%, sau đó sấy khơ ở 70 °C. Pectin thu đƣợc đem nghiền nhỏ và đƣợc phân đoạn theo kích thƣớc hạt. Phân đoạn có mức phân tán nhỏ đƣợc sàng qua rây có kích thƣớc mắt lƣới 74 μm. Bột mịn pectin đƣợc tạo ra nhằm mục đích tạo dung dịch huyền phù đồng nhất và phân tán đều đồng nhất để q trình khử ester hóa đƣợc thực hiện với hiệu quả cao, do mức độ ester hóa của mỗi phân tử pectin khác nhau và tốc độ khuếch tán của tác chất thủy phân đến các phân tử pectin khác nhau do đó q trình khử ester hóa sẽ khác nhau. Quá trình khử ester hóa kiềm của pectin bao gồm: bƣớc đầu trung hịa các nhóm cacboxyl tự do của axit anhydrogalacturonic và sau đó, trong q trình tăng pH của mơi trƣờng lên cao hơn 8,5, q trình khử ester hóa pectin thích hợp. Lƣợng kiềm cần thiết cho tính trung hịa của các nhóm cacboxyl nhƣ sau: 1g pectin đƣợc tạo huyền phù trong 10 ml dung dịch ethanol 50% và trong sự có mặt của chỉ thị Hintone đƣợc chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 1M trong ethanol 50% cho đến khi màu chỉ thị thay đổi. Dựa theo kết quả chuẩn độ, lƣợng kiềm cần thiết để trung hòa pectin đƣợc xác định bằng cách sử dụng phƣơng trình:
Trong đó, V1 thể tích NaOH 1M sử dụng trung hòa pectin; m là khối lƣợng pectin (g); Vo là thể tích dd NaOH 1M sử dụng để trung hòa 1g pectin.
Lƣợng dung dịch kiềm sử dụng cho q trình khử ester hóa đƣợc tính theo cơng thức:
V2: là thể tích dd NaOH 1M cần thiết cho quá trình khử ester của pectin; m là khối lƣợng của mẫu pectin (g), A là hàm lƣợng anhydrogalacturonic axit trong pectin (%), 176 là mối lƣợng mol của anhydrogalaturonic axit; DEin là mức độ ester hóa ban đầu của mẫu pectin (%); DEfin là mức độ ester hóa đạt đƣợc sau quá trình khử ester của pectin (%). Tổng thể tích kiềm cần thiết cho cả q trình khử ester của pectin đƣợc tính bằng tổng thể tích V1 và V2 đƣợc xác định nhƣ trên.
Quá trình khử ester thích hợp đƣợc thực hiện nhƣ sau: 20 gam bột pectin đƣợc tạo huyền phù trong 200 ml dung dịch ethanol 50% và khuấy mạnh, sau đó dung dịch 1M NaOH trong ethanol 50% đã đƣợc thêm vào từ từ. Quá trình trung hịa đƣợc kiểm sốt bằng sự đổi màu chỉ thị phenolphtalein đƣợc thêm vào hỗn hợp phản ứng. Màu của phenolphtalein thay đổi ở pH 8,2-10,0. Phần tiếp theo của dung dịch kiềm đƣợc thêm vào thể tích phản ứng chỉ sau khi chất chỉ thị đổi màu. Khi 95% lƣợng kiềm tính tốn đƣợc thêm vào thể tích phản ứng, mẫu đƣợc lấy để thực hiện xác định mức độ ester hóa. Từ kết quả phân tích này, tính đƣợc tổng lƣợng kiềm cần thiết sử dụng. Khi mức độ ester hóa ban đầu đã đạt đƣợc, hỗn hợp phản ứng đƣợc trung hòa bằng dung dịch HCl 1M trong ethanol 50%, tới khi dung dịch đạt đƣợc pH 5–6. Sản phẩm pectin đƣợc tách từ dung dịch nƣớc-ethanol bằng ly tâm hoặc lọc qua phễu lọc, sản phẩm đƣợc rửa ít nhất 3 lần với 300 ml dung dịch ethanol 50% và 150 ml 95% ethanol. Pectin sau khi rửa sạch đƣợc làm khô ở 70◦C.
2.2.3. Xác định một số thành phần hóa học chính của pectin
2.2.3.1. Xác định hàm lượng uronic axít
Hàm lƣợng urnic axit đƣợc xác định bằng phƣơng pháp Carbazole sử dụng axit D-gluconic làm chất chuẩn [91]. Cân chính xác 10 mg mẫu và pha trong 1 ml nƣớc cất, lắc mạnh để mẫu hịa tan hồn tồn. Sau đó, tiến hành pha loãng dung dịch 10 lần và sử dụng để xác định hàm lƣợng axit uronic. Lấy 500 μl dung dịch mẫu đã đƣợc chuẩn bị ở trên cho vào ống nghiệm. Tiếp theo, thêm vào 3 ml dung dịch A (0,9 g NaBH4 hòa tan trong 10 ml nƣớc cất + 90 ml dung dịch a axit sulfuric 98%). Phản ứng đƣợc tiến hành ở 100o
C trong thời gian 10 phút. Kết thúc phản ứng, hỗn hợp đƣợc làm lạnh nhanh trong nƣớc đá. Sau đó, thêm tiếp 200μl dung dịch B (100 mg Carbazole đƣợc hòa tan trong 100 ml cồn tuyệt đối) vào hỗn hợp và tiến hành lắc đều để thực hiện phản ứng lại ở 100oC trong 15 phút. Cuối cùng hỗn hợp phản ứng đƣợc làm lạnh nhanh đến nhiệt độ phòng, phức chất có màu hồng tƣơi và tiến hành đo độ hấp thụ quang ở bƣớc sóng λ = 530 nm. Sử dụng D – Glucuronic axit làm chất chuẩn với khoảng nồng độ từ 20 – 200 µg/ml.
2.2.3.2. Phương pháp xác định thành phần monosaccharide:
Thành phần đƣờng đơn đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [16], sau khi mẫu pectin đƣợc thủy phân trong môi trƣờng axit về các dạng các monomer. Các đƣờng đơn: glucose; galactose; rhamnose; mannose (Man); xylose (Xyl) và arabinose đƣợc sử dụng là chất chuẩn
2.2.3.3. Phương pháp xác định các chỉ số đặc trưng của pectin:
Xác định trọng lượng tương đương
Cân 0,5 g mẫu pectin cho vào bình tam giác. Tiếp theo cho thêm 5 ml ethanol 98% và 100 ml NaCl 1%. Cuối cùng, thêm 6 giọt dung dịch phenolphtalein 1% vào hỗn hợp và chuẩn độ với NaOH 0,1N đến khi màu đỏ xuất hiện thì ngừng, ghi lại thể tích NaOH đã dùng. Từ đó tính đƣợc trọng lƣợng tƣơng đƣơng nhƣ sau:
1000 NaOH NaOH W EW V C
Trong đó: EW: trọng lƣợng tƣơng đƣơng W: khối lƣợng mẫu
VNaOH: thể tích NaOH tiêu tốn CNaOH: nồng độ NaOH 0,1N
Dung dịch thu đƣợc sau khi trung hòa đƣợc giữ lại để tiếp tục xác định hàm lƣợng methoxyl.
Xác định hàm lượng Methoxyl (MI) [92] và hàm lượng axit anhydrouronic tổng (AUA) [93]
Sử dụng dung dịch đã đƣợc trung hịa ở thí nghiệm trên và thêm 25 ml sodium hydroxide 0,25N, khuấy đều và giữ ở nhiệt độ phịng 30 phút. Sau đó, thêm 25 ml HCl 0,25N và chuẩn độ bằng NaOH 0,1N. Ghi lại thể tích NaOH tiêu tốn. Hàm lƣợng MI đƣợc tính theo cơng thức: 3.1 % VNaOH CNaOH MI W
Hàm lƣợng AUA đƣợc tính theo cơng thức:
176 0.1 100 176 0.1 100 % 1000 1000 z y AUA W W
Trong đó: 1 đơn vị AUA = 176g
z: VNaOH từ xác định trọng lƣợng tƣơng đƣơng y: VNaOH tiêu tốn xác định chỉ số MI
Xác định hàm lượng ester hóa (DE)
Dựa trên số liệu thu đƣợc từ hàm lƣợng Methoxyl và AUA tổng, hàm lƣợng ester hóa (DE) đƣợc xác định theo cơng thức sau [92]:
176 % % 100 31 % MI DE AUA 2.2.4. Phƣơng pháp xác định Pb2+ và Cd2+ 2.2.4.1. Phương pháp xác định Pb2+ bằng phương pháp chuẩn độ Complexon
Nguyên tắc của phƣơng pháp:
Phân tích thể tích là phƣơng pháp phân tích định lƣợng dựa trên thể tích dung dịch chuẩn (đã biết chính xác nồng độ) cần dùng để phản ứng vừa đủ với chất cần xác định có trong dung dịch phân tích. Đây là phƣơng pháp hóa học dùng để xác định nhanh, đơn giản các nguyên tố có hàm lƣợng lớn. Dựa vào phản ứng tạo phức bền giữa Pb2+
với Complexon ở mơi trƣờng pH = 9÷10 với chỉ thị là ErioCrom đen T. Điểm tƣơng đƣơng nhận biết khi dƣ 1 giọt H2Y2-
dung dịch sẽ chuyển từ đỏ nho sang màu xanh. Pb2+ + H2Y2- → PbY2- + 2H+
Điểm tƣơng đƣơng đƣợc xác định bằng chỉ thị ErioCrom đen T: H2Ind-) Pb2+ + H2Ind- → PbInd- + 2H+
Xanh biết đỏ nho PbInd- + H2Y2- → PbY2- + H2Ind- Đỏ nho xanh biếc
Hóa chất sử dụng:
- Dung dịch chuẩn EDTA 0,01M: cân 1,861g muối EDTA sau đó định mức 500ml bằng nƣớc cất.
- Dung dịch Pb(NO3)2 0,01M: cân 1,656g muối Pb(NO3)2 sau đó định mức 500ml bằng nƣớc cất.
- Chỉ thị ErioCrom đen T: trộn lẫn 1g ErioCrom đen T và 100g NaCl sau đó nghiền nhỏ.
- Dung dịch đệm ammoniac: hòa tan 35g muối NH4Cl vào 285ml NH3, sau đó định mức 500ml bằng nƣớc cất.
2.2.4.2. Phương pháp xác định Cd2+
bằng phương pháp chuẩn độ Complexon
Chuẩn độ Cd2+
bằng EDTA trong môi trƣờng đệm Urontropin (pH = 5- 6) với chất chỉ thị xylenol da cam (H6Ind). Dung dịch chuẩn chuyển từ màu đỏ (màu của phức giữa Cd và chỉ thị) sang vàng (màu của chỉ thị tự do).
Các phản ứng:
H6Ind (vàng) + Cd2+ → H4IndCd (tím đỏ) + 2H+ H4IndCd (tím đỏ) + H2Y2- → CdY2- + H6Ind (vàng)
Cũng có thể chuẩn độ Cd ở môi trƣờng kiềm (pH = 10) với chỉ thị ErioCrom T đen. Phƣơng pháp này cho phép xác định Cd ở khoảng nồng độ 10-3M 10-4
M.
Cadimi có thể xác định với lƣợng 25mg/100ml dung dịch. Trong phép chuẩn độ complexon thì dung dịch EDTA có nồng độ từ 0,1 đến 0,01M với chỉ thị xylen da cam ở pH = 6 Cd có thể định lƣợng tới 100mg/100ml dung dịch.
2.2.5. Phƣơng pháp đánh giá khả năng hấp phụ kim loại của pectin
Thí nghiệm cơ sở đánh giá khả năng hấp phụ kim loại của pectin theo quy trình của Khotimchenko và cộng sự [5].
Đầu tiên cân một lƣợng chính xác pectin dạng bột (0,02g) cho vào dung dịch có chứa ion kim loại, phản ứng đƣợc thực hiện ở nhiệt độ phịng, bình phản ứng đƣợc đặt trên máy khuấy từ điều chỉnh tốc độ khuấy dung dịch phản ứng 500 rpm, thời gian phản ứng 120 phút. Kết thúc phản ứng, tiến hành ly tâm tách bỏ phần pectin khỏi dung dịch phản ứng, hàm lƣợng kim loại còn lại trong dung dịch đƣợc xác định bằng phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử. Kết quả đánh giá khả năng liên kết của pectin với ion kim loại đƣợc tính
tốn theo phƣơng trình sau:
Trong đó:
- Q: là hàm lƣợng ion kim loại đƣợc liên kết bởi pectin, mg/g. - V: là tổng thể tích dung dịch phản ứng, mL
- Co: là nồng độ ion kim loại ban đầu trƣớc khi phản ứng với
pectin, mg/mL. C0 (Cd): 2 mg/ml; C0 (Pb): 2 mg/ml.
- Ce: là nồng độ ion kim loại còn lại trong dung dịch sau phản ứng,
mg/mL
- m: là khối lƣợng của pectin tham gia phản ứng.
Ở các thí nghiệm tiếp theo, khảo sát lần lƣợt ảnh hƣởng của từng yếu tố nhƣ chỉ số ester, thời gian hấp phụ, tốc độ lắc, ảnh hƣởng của pH, nồng độ ion kim loại đến khả năng hấp phụ kim loại Pb, Cd bằng cách thay đổi giá trị yếu tố đó trong khi giữ 3 yếu tố còn lại ở giá trị cơ sở. Mỗi thí nghiệm đƣợc thực hiện 3 lần, kết quả hiệu suất chiết và hàm lƣợng polysaccharide là giá trị trung bình 3 lần đo.
2.2.5.1. Ảnh hưởng bởi môi trường pH xảy ra phản ứng
Để nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng pH, cần cố định nồng độ ban đầu của các dung dịch nghiên cứu (C0), thể tích hấp phụ (V= 50 ml), khối lƣợng chất hấp phụ (m = 0,02 g), thay đổi pH của dung dịch pH = 2÷8.
2.2.5.2. Ảnh hưởng của thời gian khuấy đến cân bằng phản ứng
Để nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian hấp phụ, cần cố định nồng độ
dung dịch hấp phụ ban đầu C0 (mg/l), thể tích hấp phụ (V= 40÷50 ml), khối lƣợng chất hấp phụ (m = 0,02 g) và thay đổi thời gian hấp phụ t = 5÷120 (phút).
2.2.5.3. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng cân bằng phản ứng
Tốc độ lắc có ảnh hƣởng đến khả năng cân bằng phản ứng của pectin liên kết với kim loại nặng. Tốc độ lắc của phản ứng đƣợc thực hiện ở các điều kiện khuấy khác nhau 50, 100, 150, 200 và 250 vòng/phút.
2.2.5.4. Ảnh hưởng của mức độ ester hóa (DE) của pectin
Khảo sát 03 loại pectin: Pectin tự nhiên có DE 62,0%, pectin DE 42,0% và pectin DE 21,0% để so sánh khả năng tạo liên kết của chúng với 02 ion hóa trị II là Pb2+
và Cd2+ trong cùng điều kiện pH.
2.2.5.5. Ảnh hưởng của nồng độ ban đầu của chất bị hấp phụ
Để nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ ban đầu chất bị hấp phụ, cần cố định pH của dung dịch chất bị hấp phụ, thể tích hấp phụ (V = 50 ml), khối lƣợng chất hấp phụ (m = 0,02g) và thay đổi nồng độ ban đầu chất bị hấp hấp phụ C0.
2.2.6. Phƣơng pháp vật lí
Phƣơng pháp vật lý bao gồm: phổ hồng ngoại (IR) và phổ cộng hƣởng từ
hạt nhân (NMR).
Phổ hồng ngoại đƣợc đo trên máy FT-IR Affinity-1S SHIMADZU tại Bộ mơn Hóa vơ cơ – Khoa Hóa học – Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội. Phƣơng pháp cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ NMR của mẫu nghiên cứu đƣợc đo ở nhiệt độ 70ºC, với dung môi D2O, trên máy Bruker AVANCE 500 MHz tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, sử dụng D2O làm dung môi, DSS (4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid) làm chất chuẩn nội. Với chế độ đo khử tín hiệu của nƣớc.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. CHIẾT TÁCH VÀ THU NHẬN PECTIN
Hiệu suất chiết tách pectin
%
Từ cỏ biển E. acoroides thu đƣợc phân đoạn pectin tự nhiên có hiệu suất chiết là 12,5% với các tính chất hóa học nhƣ sau:
Trọng lượng tương đương EW
VNaOH: thể tích NaOH tiêu tốn từ xác định trọng lƣợng tƣơng đƣơng (z)
g/mol
Hàm lượng Methoxyl (MI)
VNaOH: thể tích NaOH tiêu tốn từ xác định chỉ số MI (y)
%
Hàm lượng axit anhydrouronic tổng (AUA)
%
Hàm lượng ester hóa (DE)
Bảng e3.1: Các chỉ số đặc trƣng của pectin từ cỏ biển E. acoroides.
Thành phần Đơn vị tính Hàm lƣợng
AUA % 50,3
DE % 62,0
MI % 8,9
Hàm lƣợng pectin trong cỏ biển E. acoroides sinh trƣởng tại khánh Hòa tƣơng đƣơng với hàm lƣợng pectin ở một số loài cỏ biển khác trên thế giới nhƣ: cỏ Zostera caespitosa Miki (10,8%) [6]; Zostera marina (10-11%),
Zostera pacifica (12%) [94], và cao hơn so với hàm lƣợng pectin từ cỏ
Phyllospadix iwatensis (6,91%) [8]. So với pectin có nguồn gốc từ thực vật
trên cạn, hàm lƣợng pectin cũng có sự khác biệt đáng kể nhƣ: hàm lƣợng pectin từ vỏ chanh (10,3-13,13%) [95], vỏ chanh dây (2,25-14,6%) [96], vỏ măng cụt Indonesia (1,16%) [96], vỏ cam (7,3-16,0%) [97]. Sự khác biệt này đƣợc giải thích bởi phƣơng pháp chiết cũng nhƣ nguồn nguyên liệu khác nhau.
Theo [6] thì hàm lƣợng AUA là chỉ số đánh giá độ tinh khiết của pectin chiết xuất từ nguồn nguyên liệu tự nhiên và sản phẩm pectin có độ tinh khiết cao thì chỉ số AUA tổng phải lớn hơn 65%. Tuy nhiên, theo liệu bảng 3.1. cho thấy hàm lƣợng AUA là 50,3 % nhƣ vậy pectin mà chúng tơi nhận đƣợc có độ tinh khiết khơng cao mà là dạng pectin dạng thơ do trong quy trình chiết chƣa qua giai đoạn tinh chế.
Khối lƣợng phân tử tƣơng đƣơng EW và chỉ số methoxyl (MI) là thông số quan trọng đánh giá khả năng tạo gel của pectin và các pectin thƣơng mại thƣờng có hàm lƣợng methoxyl nằm trong khoảng từ 8-11% [98]. Pectin thu nhận từ cỏ biển E. acoroides (bảng 3.1) có EW tƣơng đƣơng pectin với một
số pectin từ vỏ chanh, vỏ cam và pectin thƣơng mại. Điều này chứng tỏ rằng pectin từ cỏ biển có thể sử dụng nhƣ là tác nhân tạo gel.
Theo các kết quả nghiên cứu trƣớc đây, pectin thu nhận từ hai loài cỏ biển Z. marina và Phyllospadix iwatensis có chỉ số DE lần lƣợt là 7,9% và
10,2% [8]; những giá trị này thấp hơn nhiều so với pectin thu từ cỏ biển E. acoroide (bảng 3.1). Nhƣ vậy, pectin thu nhận từ cỏ biển E. acoroide trong
nghiên cứu hiện tại có chỉ số DE khá cao so với các loài cỏ biển đã đƣợc nghiên cứu và đƣợc cơng bố trƣớc đó. Sự khác nhau này có thể đƣợc giải thích nhƣ sau: Pectin chiết từ cỏ biển E. acoroides đƣợc thu nhận tại biển
Khánh Hòa của Việt Nam, là vùng biển nhiệt đới khác hoàn toàn so với pectin từ Z. marina và Phyllospadix iwatensis thu tại vùng biển ôn đới của Nga. Sự